Phân tích thành phần hóa học, khả năng chống oxi hóa và chống viêm của các phân đoạn tinh dầu húng quế
Hailong Li, Yanhui Ge, Zhimin Luo, Yulan Zhou, Xuguang
Zhang, Junqing Zhang, Qiang Fu (2017): “Evaluation of the chemical composition,
antioxidant and antiinflammatory activities of distillate and residue fractions
of sweet basil essential oil”, J Food Sci
Technol; 54(7):1882–1890
Biên dịch: Phạm Ngọc Sơn
Tóm tắt
Nghiên cứu này nhằm phân tích thành phần hóa học, khả năng
chống oxi hóa và chống viêm của cây Húng quế (Ocimum basilicum L., họ Lamiaceae). Húng quế là một loại cây ăn được,
thường được dùng trong y học cổ truyền Trung Quốc. Dầu Húng quế ban đầu được
chưng cất phân tử và sử dụng kỹ thuật sắc ký khí kết nối khối phổ (GC-MS) để
sàng lọc các hợp chất mới, cụ thể, đã xác định được 38 hợp chất bằng phương
pháp GC-MS. Trong đó, các hợp chất chính trong phân đoạn cặn gồm estragole
(17.06%), methyl eugenol (11.35%) và linoleic acid (11.40%), trong khi ở phân
đoạn bay hơi, các chất methyl eugenol (16.96%), α-cadinol (16.24%) và α-bergamotene (11.92%) là các thành phần chủ đạo. Khả
năng chống oxi hóa (thí nghiệm DPPH và ABTS) và chống viêm (trên dòng tế bào
RAW264.7) cũng được đánh giá, theo đó, phân đoạn cặn có khả năng chống oxi hóa
cao, cụ thể ở thí nghiệm DPPH, IC50= 1.092 ± 0.66 mg/mL, và ở thí nghiệm ABTS, IC50=
0.707 ± 0.042 mg/mL). Trong
khi đó, phân đoạn bay hơi lại có thể ức chế sinh cytokine viêm (TNF-α, IL-1β,
IL-6) và ức chế biểu hiện của các gene liên quan trên dòng tế bào Raw 264.7, đồng
thời làm giảm lượng NO và iNOS trên mô hình in
vitro khi so sánh với tinh dầu ban đầu. Tóm lại, các phân đoạn thu được từ
tinh dầu thô ban đầu có đặc tính chống oxi hóa và chống viêm khác nhau, và được
xem như một nguồn chất chống oxi hóa và chống viêm tự nhiên sau khi được chưng
cất phân tử. Do đó, có thể tối ưu hóa các đặc điểm của loại tinh dầu này để sử
dụng trong điều trị các chứng rối loạn do stress oxi hóa.
Từ khóa: Húng quế, chưng cất phân tử,
chống oxi hóa, chống viêm
Giới thiệu
Stress oxi hóa là sự mất cân bằng giữa lượng gốc tự do tâm
oxy (ROS) và khả năng chống oxi hóa của sinh vật (Persson cà cs (2014)). Các thương tổn do gốc tự do gây ra trong quá trình
stress oxi hóa cũng đồng thời làm tăng nguy cơ gây bệnh hoặc làm tăng tiến
trình bệnh ví dụ như Parkinson, Alzheimer, các bệnh tim mạch và viêm nhiễm
(Lopez-Alarcon và Denicola (2013), Maulik và cs (2013), Toda (2011)). Trong đó,
chúng ta đã biết về mối liên hệ giữa các bệnh viêm mãn tính với trạng thái
stress oxi hóa. Cơ bản thì các gốc tự do và các chất chống oxi hóa tác động tới
hệ miễn dịch, gây rối loạn tín hiệu tế bào, gây thương tổn cho các quá trình
chuyển hóa arachidonic acid, và làm tăng cường đáp ứng viêm (Moreno-Macias và
Romieu 2014). ROS làm tăng đáp ứng viêm khi các thực bào kích thích quá trình
phosphoryl hóa oxi hóa và làm tăng khả năng chống oxi hóa của tế bào.
Thành phần hóa học của các loại dược liệu từ lâu đã không được
chú trọng nghiên cứu. Tinh dầu của các loài thực vật khác nhau có những đặc
tính sinh học rất khác biệt, ví dụ như khả năng chống oxi hóa và chống viêm.
Húng quế có thể dễ dàng mua trên thị trường và thường được sử dụng trong nấu nướng,
ví dụ như trong các món thịt và súp (Ozcan và Chalchat (2002). Machale và vs (1997)).
Hơn nữa, ở nhiều quốc gia khác, Húng quế cũng là một loài thực vật được dùng
nhiều trong y học, đặc biệt là tinh dầu húng quế có thể được dùng khi bị rắn cắn,
cảm lạnh và điều trị viêm mũi.
Các nghiên cứu trước đây đã cho thấy, có thể sử dụng phương
pháp chưng cất phân tử (MD) để tách chiết hoặc tinh sạch các thành phần hóa học
trong loài cây này, ví dụ như acid béo (Solaesa và cs (2016)), bio-oil (Wang và
cs (2015)). Đối với các loại tinh dầu nhạy cảm với nhiệt độ, MD là một phương
pháp hiệu quả để tách chiết các hợp chất nhạy cảm với nhiệt (Isbell và Cermak (2004)).
Với phương pháp MD, mẫu ban đầu sẽ được xử lý với áp suất thấp và nhiệt độ, khi
đó, nhờ khoảng cách giữa bề mặt vùng bay hơi và vùng ngưng tụ nhỏ, tinh dầu sẽ
vẫn giữ nguyên đặc tính của chúng. Hơn nữa, rất nhiều kỹ thuật đã được đưa vào
nhằm làm tăng nồng độ các thành phần trong tinh dầu, nhờ vậy nâng cao được tính
hiệu quả của phương pháp (Wang và cs (2013, 2014)). Mặc dù đã có rất nhiều công
trình sử dụng MD trong nghiên cứu tách chiết tinh dầu, nhưng chưa có nhiều
nghiên cứu đi sâu vào đánh giá hoạt tính của từng phân đoạn (Martins và cs (2012),
Borgarello và cs (2015)).
Do đó, nghiên cứu này nhằm đánh giá khả năng chống oxi hóa
và chống viêm của 2 phân đoạn tinh dầu húng quế từ phương pháp MD. Đồng thời
xác định các thành phần hóa học trong các phân đoạn để có cái nhìn rõ nét hơn về
vai trò của chúng.
Vật liệu và phương pháp
Hóa chất và thiết bị
Tinh dầu Húng quế thô (Co) được cung cấp bởi Vườn cây gia vị
Phong Thanh (Fengsheng Herb Garden), mẫu được làm khô với muối sodium sulfate
khan (Na2SO4), lọc và bảo quản ở nhiệt độ 4oC.
Các hóa chất potassium persulfate (K2S2O4), 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl
(DPPH), 2,20- azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS),
dimethylsulfoxide (DMSO), methyl eugenol (Me) và estragole (Es) được mua từ
Công ty Hóa chất Macklin (Thượng Hải, Trung Quốc). Lipopolysaccharide (LPS từ
Escherichia coli, 055:B5) và 3-(4,5-dimethylthiazol- 2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium
bromide (MTT) do Công ty Realtime (Bắc Kinh, Trung Quốc) cung cấp. Phosphoric
acid, penicillin–streptomycin và môi trường Dulbecco’s modified Eagle’s (DMEM)
được cung cấp bởi Công ty Công nghệ Sinh học Boster (Vũ Hán, Trung Quốc). Các mồi
cho β-actin, IL-1β, IL-6 và TNF-α do công ty GenoMax (Bắc
Kinh, Trung Quốc) cung cấp. Master Mix SYBR được đặt hàng từ công ty Công nghệ
Sự sống Invitrogen (USA). Kit tách RNA tổng số được mua từ Công ty Công nghệ
sinh học Foregene (Thành Đô, Trung Quốc).
Các phân đoạn thu được từ MD
Phân đoạn bay hơi (Df) và phân đoạn cặn (Rf) của mẫu tinh dầu
thô ban đầu thu được bằng phương pháp MD chạy trên hệ thống chưng cất phân tử
KDL-5 (Công ty UIC, Đức) (Hình S1). Nhiệt độ bay hơi và áp suất hoạt động là 4oC
và 80 Pa. Tốc độ dòng là 2 mL/phút, và tốc độ quay của thanh cuốn là 200 rpm.
Thành phần hóa học của tinh dầu Húng quế thô và của 2 phân đoạn
Thành phần hóa học của tinh dầu Húng quế thô và của 2 phân
đoạn được xác định bằng hệ thống sắc ký khí kết nối khối phổ Agilent
GC–MSHP6890/5973. Nghiên cứu sử dụng cột silicon DB-5 MS (30m x 0.25 mm x 0.25µm) (Công ty J&W,
USA) để phân tích mẫu. Điều kiện phân tích: Nhiệt độ từ 80-150oC (5oC/phút),
duy trì trong 10 phút, sau đó lên nhiệt từ 150-220oC (10oC/phút)
(duy trình trong 9 phút). Mẫu được tiêm (thể tích= 0.6 µL) ở chế độ phân tách (1:100), khí helium được dùng
để làm khí mang với tốc độ dòng 1 mL/phút. Nhiệt độ tiêm được duy trì ở 220oC.
Bằng cách so sánh với phổ khối chuẩn ở cùng điều kiện, xác định được các hợp chất
methyl eugenol và estragole có trong mẫu. Các hợp chất còn lại được định danh bằng
cách so sánh với phổ khối từ NIST05 (Viện Tiêu chuẩn và Công nghệ Quốc gia, US)
và thư viện WILEY 275.
Xác định khả năng chống oxi hóa
Khả năng quét gốc tự do: Thí nghiệm DPPH
Khả năng quét gốc tự do của mẫu được xác định bằng phương
pháp DPPH với một số thay đổi (Zheng và cs (2015)). 2mL mẫu với các nồng độ
khác nhau (0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.2, 1.6, 2.0 mg/mL) được trộn với 2 mL dung dịch
DPPH 0.04% pha trong methanol. Sau khi ủ ở nhiệt độ 25oC, 30 phút,
trong điều kiện tối, hỗn hợp được đo hấp thụ ở bước sóng 517 nm (Asample).
Mẫu trắng được chuẩn bị tương tự như mẫu thử, nhưng không có dung dịch mẫu tinh
dầu, ký hiệu là Ablank. Khả năng chống oxi hóa của mẫu được xác định
bằng lượng DPPH bị ức chế, hay phần trăm ức chế (I%):
% ức chế= 100(Ablank – Asample)/Ablank
Khả năng chống oxi hóa của mẫu được đánh giá thông qua chỉ số
IC50, hay nồng độ tinh dầu cần thiết để làm giảm 50% DPPH. Tất cả
các mẫu đều được đo lặp lại 3 lần.
Thí nghiệm ABTS
Thí nghiệm ABTS nhằm xác định khả năng quét gốc tự do thông
qua cation ABTS+ (Yu và cs (2015)).
Dung dịch ABTS gốc được pha bằng methanol thành nồng độ 7 mM, sau đó được
trộn với dung dịch K2S2O4 2.45 mM với tỷ lệ
1:1. Dung dịch này được bảo quản trong tối, qua đêm trước khi được sử dụng.
Dung dịch được pha với nước, sao cho cường độ hấp thụ ở 734 nm là 0.7 ± 0.02. Mẫu được pha bằng
methanol thành 5 mốc nồng độ (0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.2, 1.6, 2.0 mg/mL), và phản
ứng với 2 mL dung dịch ABTS. Sau khi ủ ở nhiệt độ phòng trong 6 phút, mẫu được
đo giá trị hấp thụ ở 734 nm, và tính khả năng ức chế tương tự như trong thí
nghiệm DPPH.
Nuôi cấy và xử lý tế bào Raw264.7
Dòng đại thực bào Raw264.7 được Công ty Công nghệ Sinh học
Boster (Vũ Hán, Trung Quốc) cung cấp. Tế bào được nuôi cấy với môi trường DMEM
có bổ sung penicillin (100U/mL), streptomycin (100 µg/mL) và 10% huyết thanh thai bò (FBS) (Gibco BRL
Life Technologies, USA), trong điều kiện 5% CO2, 37oC.
Thu tế bào ở pha log và chuyển sang đĩa cấy kích thước trung bình. Thu dịch
nuôi cấy và tế bào để thực hiện thí nghiệm ELISA và phản ứng PCR phiên mã ngược
(RT-PCR - reverse transcription-polymerase chain reaction).
Đánh giá khả năng sống của tế bào
Tế bào Raw264.7 ở pha log (2 x 105
tế bào/giếng) được chuyển sang đĩa 96 giếng, ủ tiếp tục trong 12h trước khi được
xử lý với mẫu thử. Tế bào đối chứng được ủ với 0.1% DMSO. Sau 24 giờ, bổ sung
10 µL MTT (5.0 µg/mL) vào mỗi giếng và ủ
tiếp trong 4 giờ. Sau đó, loại bỏ môi trường, tế bào được pha với 100 µL DMSO và lắc trong 10
phút. Sử dụng hệ thống đọc đĩa (Bio-Tek, EL-808, USA) để xác định mật độ quang ở
490 nm. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, kết quả được ghi lại dưới dạng giá trị
trung bình ± SD.
Xác định lượng nitrite oxide (NO) được tạo thành
Lượng NO tạo thành được xác định
thông qua nồng độ nitrite (NO2-) trong dịch nuôi cấy. Đầu
tiên, dịch nuôi cấy được pha với chất thử Griess (0.1% N-(1-naphthyl) ethylenediamine
dihydrochloride pha trong nước và 1 % sulfanilamide pha trong 5% H3PO4)
(Promega, USA) theo tỷ lệ 1:1 và cho vào đĩa 96 giếng, ủ ở nhiệt độ phòng trong
10 phút. Indomethacin (In) được dùng là đối chứng dương, các mẫu được đo giá trị
hấp thụ ở 540 nm bằng hệ thống đọc đĩa (Bio-Tek, Eon, USA). Lượng NO được tính
toán dựa trên đường chuẩn sodium nitrite.
Thí nghiệm iNOS
Tế bào được xử lý với LPS 1 µg/mL trong 12 giờ và rửa
2 lần với PBS, sau đó được ủ với dung dịch thử. Sau 12 giờ, phá tế bào với dung
dịch RIPA, ly tâm 12,000 rpm trong 30 phút. Lượng iNOS được xác định bằng kít photocolorimetrickit
(Viện Kỹ thuật sinh học Nanjing Jiancheng, Nam Kinh, Trung Quốc) với quy trình
của nhà sản xuất. Indomethacin được dùng làm đối chứng dương.
Thí nghiệm cytokine
Lượng IL-1β, IL-6 và TNF-α trong môi trường nuôi cấy được xác định bằng các bộ
kít ELISA IL-1β,
IL-6 và TNF-α (Boster, Vũ
Hán, Trung Quốc) theo quy trình của nhà sản xuất. Kết quả được đo ở 450 nm bằng
hệ thống đọc đĩa (Bio-Tek, EL-808, USA). Trong đó, indomethacin được dùng làm đối
chứng dương. Tất cả các mẫu được đo 2 lần và có thể lặp lại nhiều hơn nếu số liệu
có vấn đề.
Tách RNA và phân tích RT-PCR
Mẫu RNA tổng số được tách bằng kít theo hướng dẫn của nhà sản
xuất. RNA sau khi tách được hòa lại với nước không có nuclease và định lượng
RNA bằng máy đo quang phổ UV GeneQuant Pro (Eppendorf, BioPhotometer plus). Kết
quả RNA được đánh giá một lần nữa bằng hình ảnh điện di gel agarose. RNA tổng số
(2.5 µg) được chuyển thành cDNA bằng kit tổng hợp chuỗi cDNA (Thermo
Scientific). Theo đó, mẫu được ủ theo chu trình nhiệt: 30oC, 30
phút; 42oC, 30 phút; và 92oC, 2 phút. cDNA được bảo quản ở
-20oC. Biểu hiện của các gene đích được xác định bằng phương pháp
realtime-PCR với bộ Master Mix Kit One Step SYBR (Kim và vs (2009)). Mồi khuếch
đại các gene IL-1β,
IL-6 và TNF-α được
mô tả ở bảng 1. Phản ứng RT và bán định lượng RT-PCR được thực hiện trên máy
luân nhiệt (Stratagene Mx3005P Agilent Technologies, USA); mỗi chu trình nhiệt
đều có bước biến tính ở 95oC trong 30 giây, gắn mồi ở 55oC
trong 30 giây và kéo dài ở 72oC trong 30 giây. Biểu hiện của mRNA
IL-1β, IL-6 và TNF-α được đánh giá thông qua β-actin, một gene
housekeeping có biểu hiện ổn định.
Bảng
1: Trình tự mồi cho phản ứng realtime-PCR
Gene
|
Mồi xuôi
|
Mồi ngược
|
β-actin
|
5’-TGG ATTCCT GTG GCA TTC ATG AAA C-3’
|
5’-TAA AAC GCA GCT CAG TTA CAG TCC G-3’
|
IL-1β
|
5’-TGA AGG GCT GCT TCC AAA CCT TTG ACC-3’
|
50-TGT CCA TTG AGG TGG AGA GCT TTC AGC-3’
|
IL-6
|
5’-TGG AGT CAC AGA AGG AGT GGC TAA G-3’
|
50-TCT GAC CAC AGT GAG GAA TGT CCA C-3’
|
TNF-α
|
5’-GCG ACG TGG AAC TGG CAG AAG-3’
|
50-TCC ATG CCG TTG GCC AGG AGG-3’
|
Phân tích số liệu
Kết quả của tất cả các thí nghiệm đều
được biểu diễn ở dạng giá trị trung bình ± SD. Nghiên cứu sử dụng phương pháp ANOVA và t-test
trên phần mềm SPSS 13.0. Kết quả được xem là có ý nghĩa thống kê khi *p<0.05
và **p<0.01.
Kết quả
Thành phần hóa học của tinh dầu thô
Tinh dầu thô (màu vàng) được chia
thành 2 phần: các hợp chất kích thước nhỏ (có điểm sôi thấp) sẽ bám trên bề mặt
làm lạnh, có màu vàng sáng; các phân tử có kích thước lớn hơn sẽ bám trên bề mặt
nóng và có màu nâu sậm (Hình S2).
Kết quả phân tích GC-MS (Bảng 2)
cho thấy, các hợp chất chính trong tinh dầu là linalool (5.51%), estragole
(43.92%), methyl eugenol (7.34%) và α-bergamotene
(12.31%). Các thành phần này chiếm 69.08% khối lượng tinh dầu thô. Phân đoạn cặn
gồm estragole (17.06%), methyl eugenol (11.35%), α-cadinol (10.01%),
hexadecanoic acid (10.84%) và linoleic acid (11.40%), các chất này chiếm 60.66%
khối lượng phân đoạn cặn. Phân đoạn bay hơi chứa estragole (13.00%), methyl
eugenol (16.96%), α-cadinol (16.24%), α-bergamotene (11.92%) và carotol
(5.75%), các chất này chiếm 63.87% khối lượng phân đoạn bay hơi. Kết quả này
tương tự với nghiên cứu của Arranz và cs (2015) và Rodrigues và cs (2016), các
nghiên cứu này cũng ghi nhận, các thành phần chính của tinh dầu là estragole,
eugenol, α-bergamotene và linalool. Tuy nhiên, có sự khác biệt về hàm lượng các
chất này trong tinh dầu theo các nghiên cứu này và nghiên cứu của chúng tôi.
Estragole (17.06%) được xem là thành phần chính của phân đoạn cặn, trong khi
methyl eugenol (16.96% là thành phần chính của phân đoạn bay hơi.
Bảng
2: Các thành phần hóa học của mỗi phân đoạn tinh dầu Húng quế sau khi chứng cất
phân tử
Đỉnh
|
Thời gian lưu
|
Thành phần
|
Diện
tích đỉnh
|
||
Df
|
Rf
|
Co
|
|||
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
Tổng
|
3.65
3.90
4.10
4.17
4.33
5.03
5.09
5.17
5.30
5.60
6.15
6.46
7.60
8.41
8.89
10.76
12.64
13.21
13.30
13.43
13.86
14.61
15.98
17.31
18.05
18.88
19.32
19.84
20.58
21.54
23.37
24.08
30.15
31.32
32.12
34.25
35. 49
35.85
|
α-Pinene
Camphene
2,6,6-Trimethyl-2-vinyl-tetrahydropyran
Sabinene
β-Myrcene
1-Methyl-2-(1-methylethyl)-benzene
Limonene
Eucalyptol
Trans-b-ocimene
γ-Terpinene
α-Terpinolene
Linalool
Camphor
4-Terpineol
Estragole
(–)-Bornyl acetate
Eugenol
γ-Elemene
β-Bourbonene
β-Elemene
Methyl eugenol
α-Bergamotene
Germacrene
Calamenene
α-Calacorene
Nerolidol
Veridiflorol
Spathulenol
Epiglobulol
Carotol
α-Cadinol
t-Muurolol
Caryophyllene oxide
Isophytol
Hexadecanoic acid
Phytol
Linoleic acid
Octadecanoic acid
|
-
-
-
-
-
-
-
0.65
0.36
-
-
0.97
0.69
-
13.00
0.43
0.89
0.70
0.83
1.71
16.96
11.92
1.98
1.84
0.96
0.72
0.57
2.75
0.87
5.75
16.24
2.47
1.35
0.89
0.64
-
-
-
86.14
|
-
-
-
-
-
-
0.08
0.30
0.15
-
-
1.49
0.11
-
17.06
0.50
0.86
-
-
1.30
11.35
8.74
0.99
1.02
0.59
0.43
0.27
3.75
0.47
1.71
10.01
2.23
1.98
0.35
10.84
0.78
11.40
0.99
89.32
|
0.27
0.11
0.08
0.08
1.35
0.23
0.79
3.32
1.79
0.11
0.42
5.51
0.59
0.19
43.92
1.01
0.44
0.16
0.17
2.25
7.34
12.31
1.45
0.78
-
-
-
0.48
-
0.45
2.63
-
-
-
0.76
-
0.77
-
89.76
|
Df là phân đoạn bay hơi, Rf là phân đoạn
cặn, Co là tinh dầu Húng quế thô
Khả năng chống oxi hóa
DPPH và ABTS là 2 phương pháp phổ
biến trong đánh giá khả năng quét gốc tự do của các hợp chất tự nhiên. Khả năng
chống oxi hóa của hợp chất được thể hiện bởi khả năng quét gốc tự do, và được
ghi nhận bởi giá trị hấp thụ (Zhou và cs 2016). Ở bảng 3, các kết quả chỉ ra,
khả năng quét gốc tự do giảm dần theo trình tự Rf>Me>Df>Co>Es. Gốc
tự do ABTS được tạo thành từ potassium persulfate và có màu xanh lá cây xậm, bước
sóng hấp thụ cực đại ở 734 nm, cường độ hấp thụ của dung dịch sẽ giảm dần dưới
sự có mặt của các chất chống oxi hóa. Kết quả này cũng chứng minh khả năng quét
gốc tự do giảm dần theo trình tự Rf>Df >Me>Co>Es. Cũng từ kết quả
trên, phân đoạn cặn có khả năng chống oxi hóa DPPH và ABTS cao nhất. Tuy nhiên,
estragole lại có khả năng chống oxi hóa thấp. Kết quả này tương tự với nghiên cứu
của Lee và cs (2005).
Bảng
3: Khả năng quét gốc tự do (DPPH, ABTS) của các phân đoạn tinh dầu
IC50
|
Co
(mg/mL)
|
Df
(mg/mL)
|
Rf
(mg/mL)
|
Me
(mg/mL)
|
Es
(mg/mL)
|
Khả năng quét DPPH
|
2.008 ± 0.128
|
1.729 ± 0.056
|
1.092 ± 0.066
|
1.287 ± 0.037
|
-
|
Khả năng quét ABTS
|
2.136 ± 0.030
|
1.390 ± 0.058
|
0.707 ± 0.042
|
1.675 ± 0.028
|
-
|
Giá trị được biểu diễn dưới dạng giá
trị trung bình ± SD (n=3)
Df là phân đoạn bay hơi, Rf là phân đoạn
cặn, Co là tinh dầu Húng quế thô, Me là methyl eugenol, Es là estragole
Ảnh hưởng của phân đoạn tinh dầu tới khả năng sinh NO và iNOS dưới kích thích của LPS
Kết quả thí nghiệm MTT cho thấy, ở
nồng độ thấp (2.5-50 µg/Ml),
các phân đoạn đều ảnh hưởng tới khả năng sống của tế bào Raw264.7 (Hình 1). Do
đó, các nồng độ không gây độc của tinh dầu thô (20 µg/mL) và các hợp chất chính dạng tinh khiết (10 µg.mL) (Arranz và cs (2015))
sẽ được dùng cho các thí nghiệm kế tiếp. Sự thay đổi lượng NO sinh ra dưới sự
trung gian của iNOS chính là yếu tố chính gây ra đáp ứng viêm (Laskin và
Pendino (1995)), và lượng iNOS được xác định bằng phương pháp quang phổ. Từ
hình 2, sau khi kích thích bằng LPS, lượng NO sinh ra cũng như biểu hiện của
iNOS tăng lên mạnh, khi so sánh với tế bào Raw264.7 thường. Khi được xử lý trước
với Df, Rf và Me, tế bào sinh ít NO hơn (Hình 2a), trong khi hoạt độ của iNOS
cũng giảm nhẹ (Hình 2b), nhưng estragole không ảnh hưởng tới khả năng sinh NO
và iNOS của tế bào (Hình 2a, b).
Hình
1: Ảnh hưởng của các phân đoạn tói khả năng sống của tế bào Raw264.7. Tế bào được
nuôi cấy với các phân đoạn trong 12 giờ, sau khi được xử lý với LPS (0.1 µg/mL)
trong 12 giờ trước đó. Khả năng sống của tế bào được xác định bằng thí nghiệm
MTT. Kết quả được biểu diễn dưới dạng giá trị trung bình ±
SD với 3 lần lặp lại. Df là phân đoạn bay hơi, Rf là phân đoạn cặn, Co là tinh
dầu Húng quế thô, Me là methyl eugenol, Es là estragole.
Hình
2: Lượng (a) NO và (b) iNOS do tế bào Raw264.7 tạo ra dưới sự kích thích của
LPS, sau khi được xử lý với các phân đoạn tinh dầu. Các giá trị được biểu diễn
dưới dạng giá trị trung bình ± SD với 3 lần lặp lại. Sự
khác biệt với nhóm được xử lý với LPS được xem là có ý nghĩa thống kê khi
*p<0.05; **p<0.01. Df là phân đoạn bay hơi, Rf là phân đoạn cặn, Co là
tinh dầu Húng quế thô, Me là methyl eugenol, Es là estragole.
Ảnh hưởng của phân đoạn tinh dầu tới yếu tố cytokine gây viêm
Thí nghiệm này nhắm đánh giá tác động
của các phân đoạn tinh dầu tới sự hình thành các cytokine gây viêm của tế bào
Raw264.7. Tất cả tế bào Raw264.7 đều được xử lý với LPS và xác định lượng TNF-α, IL-1β và IL-6 bằng các kit
ELISA và bằng phương pháp RT-PCR. Kết quả cho thấy, không giống như trong báo
cáo của Rodrigues và cs 2016, estragole không tác động tới quá trình sinh
cytokine của tế bào, sự khác biệt này có thể là do sự khác biệt về nồng độ hoạt
chất được dùng. Tuy nhiên, các phân đoạn Df, Rf, cũng như Co và Me đều ức chế tế
bào sinh TNF-α,
IL-1β và IL-6 (Hình
3a, c, e). Để xác định được, liệu sự suy giảm lượng cytokine này có liên quan đến
mức độ biểu hiển của các gene liên quan hay không, nhóm đã tiến hành phân tích
bằng phương pháp RT-PCR. Kết quả ghi nhận các phân đoạn Df, Rf, cũng như Me và
Co đều làm giảm biểu hiện các gene TNF-α,
IL-1β và IL-6 (Hình
3b, d, f), kết quả này tương tự với nghiên cứu của Arranz và cs (2015). Bên cạnh
đó, phân đoạn bay hơi cũng là nhóm có khả năng chống oxi hóa tốt nhất trong các
nhóm thử (2 phân đoạn tinh dầu và tinh dầu thô) và có cơ chế hoạt động tương tự
như indomethacin (Antonisamy và cs 2016).
Hình
3: Ảnh hưởng của các phân đoạn tới TNF-α, IL-1β
và Il-6 ở mức độ phiên mã (a, c, e) và mức độ dịch mã (b, d, f), sau khi gây
kích thích tế bào Raw264.7 bằng LPC trong 24 giờ (n=3), Sự khác biệt với nhóm
chỉ được xử lý với LPS được xem là có ý nghĩa thống kê khi *p<0,05;
**p<0.01. Df là phân đoạn bay hơi, Rf là phân đoạn cặn, Co là tinh dầu Húng
quế thô, Me là Methyl eugenol, Es estragole.
Bàn luận
Các loại dược liệu đã được con người
nghiên cứu và sử trong rất nhiều năm. Húng quế là một trong các loài dược học cổ
truyền, tinh dầu thô của cây này có khả năng chống oxi hóa, chống tăng huyết áp
và chống viêm (Rodrigues và cs (2016), Chalchat và Ozcan (2008)). Bên cạnh đó,
chưng cất phân tử lại là một phương pháp hiệu quả để tách chiết các thành phần
nhạy cảm với nhiệt hay nói cách khác là các chất có điểm sôi khác nhau trong
tinh dầu thô, nhờ vậy, mẫu tinh dầu ban đầu được chia thành 2 phần. Từ kết quả
GC-MS, methyl eugenol, linoleic acid và α-cadinol
là thành phần chính của phân đoạn cắn, đây đều là các chất chống oxi hóa tự
nhiên, tham gia vào quá trình trung hòa gốc tự do và làm giảm thương tổn do
stress oxi hóa gây ra. Thông thường, các chất chống oxi hóa tự nhiên thường được
dùng trong điều trị xơ vữa động mạch, tiểu đường và cao huyết áp (Pisoschi và
Pop (2015)) và được người tiêu dùng ưa chuộng hơn do chúng không có nhiều tác dụng
phụ (Valenzuela và cs (2003), trong khi các chất chống oxi hóa nhân tạo hay do
con người tổng hợp lại thường gây ra các tác dụng phụ khi sử dụng lâu dài. Dựa
vào các nghiên cứu trước đó, tinh dầu thô Húng quế có thể được dùng như một chất
chống oxi hóa tự nhiên trong thực phẩm, thậm chí là thực phẩm hữu cơ (Arranz và
cs (2015)). Tuy nhiên, trong nghiên cứu này, kết quả lại cho thấy, phân đoạn cặn
của tinh dầu Húng quế có khả năng chống oxi hóa tốt hơn, mà chủ yếu là do các
chất chống oxi hóa trong phân đoạn này.
Tương tự như vậy, để đánh giá khả
năng chống viêm của các phân đoạn tinh dầu với tế bào Raw264.7, nghiên cứu đã
kiểm tra rất nhiều các tham số liên quan đến quá trình viêm của tế bào. Đặc
trưng của quá trình viêm trên đại thực bào là biểu hiện của iNOS, từ đó, cùng với
các kích thích của nội độc tố hay các cytokine viêm (TNF-α, IL-1β và IL-6), lượng NO nội
sinh tăng lên mạnh. Do đó, để đánh giá khả năng chống viêm của một hoạt chất,
trước hết cần kiểm tra xem khả năng ức chế sinh TNF-α và IL-1β
(Yoon và cs (2010), Dinarello (2010)), và trên một số bệnh còn kèm theo sự ngăn
cản tín hiệu IL-6 (Zhou và cs (2009))
hay làm giảm lượng IL-6. Trong nghiên cứu này, cả 2 phân đoạn (10 µg/mL) đều làm thay đổi
lượng NO và iNOS ở tế bào Raw264.7 sau khi được kích thích bằng LPS, từ đó làm
giảm lượng TNF-α,
IL-1β và IL-6. Hơn
nữa, sự giảm lượng TNF-α,
IL-1β và IL-6 này
cũng liên quan đến việc giảm biểu hiện các mRNA của các gene. Do đó, khả năng
chống viêm của Df và Rf chủ yếu là do chúng có thể thay đổi lượng cytokine nôi
bào. Ngoài ra, ở nồng độ 5 µg/mL,
Me cũng cho thấy khả năng làm giảm lượng TNF-α, IL-1β
và IL-6 cũng như ức chế biểu hiện các gene này. Do đó, Me có thể là chất chống
viêm chính trong cả 2 phân đoạn. Phân đoạn
bay hơi lại có thể ức chế cytokine viêm tốt hơn so với Rf, đây có thể là một bằng
chứng cho thấy, phân đoạn này chứa nhiều chất chống viêm hơn Rf.
Kết luận
Trong nghiên cứu này, các kết quả
đã chỉ ra phân đoạn cặn của tinh dầu Húng quế có khả năng chống oxi hóa tốt
hơn, trong khi phân đoạn bay hơi lại chống viêm hiện quả hơn. Do đó, phương
pháp chưng cất phân tử đã tạo ra hai phân đoạn có những đặc tính riêng biệt từ
tinh dầu Húng quế ban đầu, các tinh dầu này có thể được tối ưu để sử dụng như một
loại dược liệu tự nhiên.
Lời cám ơn
Nghiên cứu này nhận được sự hỗ trợ
tài chính của Quỹ Khoa học Quốc gia, tỉnh Hải Nam (số 20168269) và Quỹ Khoa học
Quốc gia Trung Quốc (số 81573391) và Dự án Trọng điểm Quốc gia Trung Quốc (số
81227802).
Tiêu chuẩn đạo đức
Nghiên cứu này không liên quan tới
bất kỳ xung đột lợi ích nào.
Tài liệu tham khảo
Antonisamy P, Arasu MV,
Dhanasekaran M, Choi KC, Aravinthan A, Kim NS, Kang CW, Kim JH (2016)
Protective effects of trigonelline against indomethacin-induced gastric ulcer
in rats and potential underlying mechanisms. Food Funct 7:398–408
Arranz E, Jaime L, Hazas MC,
Reglero G, Santoyo S (2015) Supercritical fluid extraction as an alternative
process to obtain essential oils with anti-inflammatory properties from
marjoram and sweet basil. Ind Crops Prod 67:121–129
Borgarello AV, Mezza GN, Pramparo
MC, Gayol MF (2015) Thymol enrichment from oregano essential oil by molecular
distillation. Sep Purif Technol 153:60–66
Chalchat J-C, Ozcan MM (2008)
Comparative essential oil composition of flowers, leavesand stems of basil
(Ocimum basilicum L.) used as herb. Food Chem 110:501–503
Dinarello CA (2010)
Anti-inflammatory agents: present and future. Cell 140:935–950
Isbell TA, Cermak SC (2004)
Purification of meadowfoam monoestolide from polyestolide. Ind Crops Prod
19:113–118
Kim EH, Shim B, Kang S, Jeong G,
Lee J-s YuY-B, Chun M (2009) Anti-inflammatory effects of Scutellaria
baicalensis exbitract via suppression of immune modulators and MAP kinase
signaling molecules. J Ethnopharmacol 126:320–331
Laskin DL, Pendino KJ (1995)
Macrophages and inflammatory mediators in tissue injury. Annu Rev Pharmacol
35:655–677
Lee SJ, Umano K, Shibamoto T, Lee
KG (2005) Identification of volatile components in basil (Ocimum basilicum L.)
and thyme leaves (Thymus vulgaris L.) and their antioxidant properties. Food
Chem 91:131–137
Lopez-Alarcon C, Denicola A (2013)
Evaluating the antioxidant capacity of natural products: a review on chemical
and cellularbased assays. Anal Chim Acta 763:1–10
Machale KW, Niranjan K, Pangarkar
VG (1997) Recovery of dissolved essential oils from condensate waters of basil
and Mentha arvensis distillation. J Chem Technol Biotechnol 69:362–366
Martins PF, Carmona C, Martinez EL,
Sbaite P, Maciel Filho R, Wolf Maciel MR (2012) Short path evaporation for
methyl chavicol enrichment from basil essential oil. Sep Purif Technol 87:71–78
Maulik N, McFadden D, Otani H,
Thirunavukkarasu M, Parinandi NL (2013) Antioxidants in longevity and medicine.
Oxid Med Cell Longev. doi:10.1155/2013/820679
Moreno-Macias H, Romieu I (2014)
Effects of antioxidant supplements and nutrients on patients with asthma and
allergies. J Allergy Clin Immun 133:1237–1244
Ozcan M, Chalchat JC (2002)
Essential oil composition of Ocimum basilicum L. and Ocimum minimum L. in
Turkey Czech. J Food Sci 20:223–228
Persson T, Popescu BO,
Cedazo-Minguez A (2014) Oxidative stress in Alzheimer’s disease: why did
antioxidant therapy fail? Oxid Med Cell Longev 2014:1–11
Pisoschi AM, Pop A (2015) The role
of antioxidants in the chemistry of oxidative stress: a review. Eur J Med Chem
97:55–74
Rodrigues LB, Martins AOBPB, Cesario
FRAS, Castro FF, Albuquerque TR, Fernandes MNM, Barbosa R (2016)
Anti-inflammatory and antiedematogenic activity of the Ocimum basilicum
essential oil and its main compound estragole: in vivo mouse models. Chem Biol
Interact 257:14–25
Solaesa AG, Sanz MT, Falkeborg M,
Beltra´n S, Guo Z (2016) Production and concentration of monoacylglycerols rich
in omega-3 polyunsaturated fatty acids by enzymatic glycerolysis and molecular
distillation. Food Chem 190:960–967
Toda S (2011) Polyphenol content
and antioxidant effects in herb teas. Chin Med 02:29–31
Valenzuela BA, Sanhueza J, Nieto S
(2003) Natural antioxidants in functional foods: from food safety to health
benefits. Grasas Aceites 54:295–303
Wang S, Li X, Zhang F, Cai Q, Wang
Y, Luo Z (2013) Bio-oil catalytic reforming without steam addition: application
to hydrogen production and studies on its mechanism. Int J Hydrog Energy
38:16038–16047
Wang S, Cai Q, Wang X, Zhang L,
Wang Y, Luo Z (2014) Biogasoline production from the co-cracking of the
distilled fraction of bio-oil and ethanol. Energy Fuel 28:115–122
Wang Y, Wang S, Leng F, Chen J, Zhu
L, Luo Z (2015) Separation and characterization of pyrolytic lignins from the
residue fraction of bio-oil by molecular distillation. Sep Purif Technol
152:123–132
Yoon WJ, Ham YM, Lee WJ, Lee NH,
Hyun CG (2010) Brown alga Sargassum muticum inhibits proinflammatory cytokines,
iNOS, and COX-2 expression in macrophage RAW 264.7 cells. Turk J Biol 34:25–34
Yu XM, Zhu P, Zhong QP, Li MY, Ma
HR (2015) Subcritical water extraction of antioxidant phenolic compounds from
XiLan olive fruit dreg. J Food Sci Technol 52:5012–5020
Zheng L, Liu M, Zhai GY, Ma Z, Wang
LQ, Jia L (2015) Antioxidant and anti-ageing activities of mycelia zinc
polysaccharide from Pholiota nameko SW-03. J Sci Food Agric 95:3117–3126
Zhou H, Lutterodt H, Cheng Z, Yu L
(2009) Anti-inflammatory and antiproliferative activities of trifolirhizin, a
Flavonoid from Sophora flavescens roots. J Agric Food Chem 57:4580–4585
Zhou D, Wang D, Yang L, Liu Z,
Zhang Y (2016) A Modified and improved assay based on microbial test system
(MTS) to evaluate antioxidant activity. Food Anal Methods 9:895–904
Phân tích thành phần hóa học, khả năng chống oxi hóa và chống viêm của các phân đoạn tinh dầu húng quế
Reviewed by Khoa học đời sống
on
tháng 5 10, 2020
Rating:
Reviewed by Khoa học đời sống
on
tháng 5 10, 2020
Rating:
