Phương pháp giảm nhiễu do sucrose trong phát hiện thiobarbituric acid- gốc tự do

Marshal Shlafer và Beverly M Shepard (1984): "A Method to Reduce Interference by Sucrose in the Detection of Thiobarbituric Acid-Reactive Substances”, Analytical biochemistry, 137, 269-276

Link bài gốc: https://drive.google.com/open?id=1XWJtEFBHVy09EMzPczGh-cvlH_mnEjqE

Biên dịch: Phạm Ngọc Sơn

Tóm tắt

Phản ứng của Thiobarbituric acid (TBA) với sản phẩm peroxide hóa lipid thường bị nhiễu bởi nhiều bởi các thành phần trong hỗn hợp phứn ứng hay trong dịch nghiền đồng thể mô. Các thành phần này gồm sucrose (nồng độ lên tới 100mM trong hỗn hợp phản ứng), Tris-maleate (40 mM), imidazole (20 mM), phosphate vô cơ (10 mM), và 4-morpholinepropanesulfonic acid (20 mM). Khi mẫu được đun ở nhiệt độ 95^oC, chính thành phần sucrose gây nên sự thay đổi màu sắc của hỗn hợp. Chỉ với nồng độ 10 mM, sucrose cũng có thể làm tăng khả năng hấp thụ tại 532 nm của dung dịch chuẩn tetramethoxypropane (TMP), vì vậy không nên áp dụng quy trình này cho các mẫu chứa nhiều sucrose hoặc bảo quản trong sucrose. Nhiễu do sucrose không chỉ làm giảm hiệu quả chiết n-butanol mà ở nồng độ lớn hơn 20 mM, sucrose còn làm tăng hấp thụ của dung dịch tới 50-100% khi so sánh với đối chứng không có sucrose. Khi bổ sung sucrose vào mẫu trắng và chuẩn không làm giảm nhiễu khi không chiết organic. Ngược lại, khi chiết mẫu với butanol-pyridine, việc thêm sucrose vào mẫu trắng và chuẩn cho đường chuẩn tuyến tính và đi qua gốc tọa độ, độ dốc của đường tuyến tính này tương đương với độ dốc của đường chuẩn không chứa sucrose. Quy trình đã tối ưu này cho kết quả với độ sai số chỉ khoảng 2%. Ngoài ra, việc sử dụng sucrose khi nghiền đồng thể không làm thay đổi lượng chất phản ứng với TBA khi so sánh với các mẫu được nghiền với chất không gây nhiễu, KCl.

Từ khóa: peroxide hóa lipid, thiobarbituric acid, malonaldehyde, phương pháp

Giới thiệu

Trong điều kiện bệnh lý, quá trình peroxide hóa lipid làm thay đổi rất nhiều hệ thống sinh học. Thí nghiệm thiobarbituric acid (TBA) được sử dụng rộng rãi trong đánh giá tình trạng peroxide hóa, phương pháp này có ưu điểm nhanh, độ nhạy cao và không cần nhiều thiết bị hỗ trợ, chỉ cần một máy quang phổ kế (Spectrophotometer). Tuy nhiên, vẫn có một số hạn chế của phương pháp TBA: phương pháp khó có thể đo lường các sản phẩm lipid peroxide hóa trong điều kiện in vivo (1), bên cạnh đó, có rất nhiều yếu tố có thể gây nhiễu (2-8), và kết quả phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện thí nghiệm cũng như lượng lipid có trong mẫu (4,9-12). Để thu được kết quả chính xác hơn, thí nghiệm này có thể sử dụng hệ thống HPLC, nhưng kỹ thuật này tốn nhiều thơi gian và chi phí hơn.

Trong quá trình tối ưu hóa thí nghiệm TBA, chúng tôi thấy rằng một số môi trường nuôi cấy có thể làm sai lệch số liệu khi mẫu được ủ ở 95^oC theo quy trình của Ohkawa và cs (9). Bằng cách phân tích các thành phần, sucrose là thành phần phổ biến trong các mô nuôi cấy với nồng độ thường nhỏ hơn 10 mM, chỉ với nồng độ như vậy, chúng tăng giá trị hấp thụ của chuẩn tetramethoxypropane (TMP) lên gấp hai lần. Khi nồng độ sucrose tăng lên 100 mM, chúng thậm chí tăng giá trị hấp thụ của TMP lên 5 lần so với đối chứng không có sucrose. Chiết bằng butanol-pyridine chỉ có thể phần nào giảm nhiễu của thí nghiệm. Chúng tôi cho rằng có thể giảm gần như hoàn toàn nhiễu do sucrose bằng cách bổ sung sucrose vào trong mẫu trắng và chuẩn TMP.

Vật liệu và phương pháp

Chuẩn Tetramethoxypropane (TMP)

Malonaldehyde bis (dimethyl acetal ) [1,1,3,3-tetramothoxypropane, TMP] được cung cấp bởi hãng Aldrich (Milwaukee, Wisc.). Cân chuẩn sao cho nồng độ cuối cùng là 1 mM, bột được cho vào bình định mức 1 lít, bổ sung 500 ml nước và 1 ml HCl 1N, sau đó đun nóng bình ở 50^oC trong 60 phút và làm mát xuống 25^oC, bổ sung nước để đủ 1000 ml. Để không làm thay đổi giá trị hấp thụ của chuẩn, dung dịch được bảo quản tối, ở 4^oC trong tối đa 1 tháng. Nước dùng để pha chuẩn là nước cất 2 lần và đã lọc qua hệ thống Hydro-Services (Durham, N.C) với 1 cột lọc chất hữu cơ OA-18 và 2 cột lọc lọc ion DM-18M.

Đánh giá độ nhiễu của phương pháp truyền thống

Đầu tiên, chúng tôi đánh giá khả năng tác động của các thành phần thường có trong hỗn hợp phản ứng theo quy trình của Ohkawa và cs (9) tới độ hấp thụ của chuẩn TMP (1-10 nmol). Chúng tôi đã tối ưu hóa quy trình và đưa ra nồng độ cuối: Sucrose (chất đủ tinh sạch để phân tích, 0.88 M, Mallinckrodt); 4-morpholinepropanesulfonic acid (Mops, 0.15 M, Sigma); Tris-maleate (0.2 M, Trizma maleate, Sigma); imidazole (0.09 M, Sigma), và đệm kali phosphate (0.05 M, pH 8.0, Sigma). Các chất này không làm thay đổi pH của môi trường phản ứng. Để tránh làm thay đổi thể tích, chúng tôi giảm một lượng nước tương đương với thể tích các chất bổ sung vào. Dung dịch chuẩn và dịch chiết butanol-pyridine của nó được đo hấp thụ tại 532 nm với mẫu trắng là dung dịch không chứa TMP và các chất bổ sung. Giá trị hấp thụ của dung dịch chuẩn có chứa các chất bổ sung được so sánh với dung dịch chuẩn không chứa chất bổ sung nhưng có cùng lượng TMP.

Với thí nghiệm trên, chúng tôi thấy rằng, chỉ có sucrose là yếu tố gây nhiễu (xem phần Kết quả). Chúng tôi tiến hành tối ưu quy trình TBA để sử dụng cho mẫu sinh học, đây là các mẫu thường được bảo quản trong hoặc chứa sucrose.

Tối ưu hóa quy trình TBA cho mẫu có chứa sucrose

Dung dịch TMP chuẩn có dải nồng độ từ 1-10 nmol và dược pha bằng dung dịch gồm 200 µl sodium dodecyl sulfate (SDS) 8.1% (w/v), 1.5 ml acetic acid 20% (v/v) (đã chỉnh pH xuống 3.5 bằng NaOH 5N), và 0.8 ml nước cất. Ngoài ra, chuẩn bị một dung dịch khác tương tự nhưng bổ sung sucrose để phân tích các mẫu sinh học. Cuối cùng, bổ sung vào các dung dịch trên 1.5 ml TBA 0.8% (w/v) (Eastman Organic Chemicals) và lắc đều hỗn hợp. Mẫu trắng có chứa tất cả các thành phần trên ngoại trừ TMP.

Các mẫu sinh học

Để phân tích các thành phần phản ứng với TBA trong mẫu sinh học, mỗi mẫu được kiểm tra lặp lại 2-3 lần với thành phần hỗn hợp tương tự như trên nhưng thay TMP bằng 100-400 µl mẫu sinh học và điều chỉnh về thể tích 2.5 ml bằng nước trước khi bổ sung TBA. Nếu lượng sucrose bổ sung làm thay đổi thể tích phản ứng, cần điều chỉnh các ống mẫu trắng và chuẩn để có thể tích tương đương với ống chứa sucrose.

Ủ ống ở nhiệt độ 95^oC trong 60 phút, cần lưu ý rằng, nhiệt độ ủ và thời gian ủ là hai yếu tố rất quan trong trong phản ứng, không nên có các thay đổi không cần thiết. Sau khi ủ, các mẫu được làm mát ở nhiệt độ phòng, Bổ sung vào các ống nghiệm 5 ml dung dịch n-butanol và pyridine (15:1, v/v), lắc đều và ly tâm 2200 xg trong 10 phút, hút pha organic bằng pipet và đo giá trị hấp thụ của pha này ở bước song 532 nm với mẫu trắng.

Thí nghiệm với dịch nghiền đồng thể mô

Các mẫu tim, phổi, gan và cơ của thỏ được bảo quản trong môi trường chứa 0.25 m\M sucrose và 5 mM Tris-maleate (pH 6.8 ở 4^oC) với thể tích gấp 4 lần thể tích mẫu (1ml cho 1 g mẫu), hỗn hợp được nghiền đồng thể bằng máy Tekmar Tissuemizer (Tekmar Instruments, Cincinnati). Bổ sung môi trường lạnh vào dịch nghiền đồng thể để thu được 10 ml dịch đồng thể từ 1g mẫu mẫu ban đầu. Khi phản ứng TBA, mỗi mẫu được đo 2-3 lần theo quy trình đã mô tả ở trên. Giá trị hấp thụ của dung dịch cuối vẫn được đo ở bước song 532 nm với mẫu trắng và chuẩn TMP có cùng thể tích.

Đối với mẫu gan, mẫu được chia làm 2 nhóm, một nhóm được bảo quản trong KCl 1.15% (w/v) như trong quy trình của Ohkawa và cs (9) và một mẫu được bảo quản trong môi trường chứa sucrose như đã mô tả ở trên. 2 nhóm mẫu này được nghiền đồng thể, phản ứng với TBA tương tự nhau như theo quy trình đã mô tả ở trên, và so sánh lượng chất phản ứng với TBA trong 2 mẫu. Bên cạnh đó, chúng tôi cũng xây dựng đường chuẩn lượng TMP có trong các mẫu này.

Các thí nghiệm có thể được thực hiện trong nhiều ngày và tổng hợp lại dữ liệu. Để đánh giá độ nhiễu do sucrose và khả năng ứng dụng của quy trình mới, chúng tôi sử dụng nồng độ đường 20 mM.

Kết quả

Độ nhiễu do các chất bổ sung

Kết quả từ bảng 1 cho thấy, Mops (nồng độ cuối 20 mM), Tris-maleate (40 mM), imidazole (20 mM) và phosphate vô cơ (10 mM) không làm thay đổi giá trị hấp thụ của TMP chuẩn 1-10 nmol ở bước sóng 532 nm (số liệu trong bảng 1 là của mẫu chuẩn 4 nmol), trong đó, giá trị hấp thụ của mẫu ban đầu và mẫu sau chiết với butanol-pyridine được đưa ra so sánh. Mặc dù Mops có làm giảm giá trị hấp thụ của hỗn hợp nhưng sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê. Ngược lại, sucrose lại làm thay đổi giá trị hấp thụ của phản ứng, khi nồng độ cuối lớn hơn 10 mM, sucrose làm tăng giá trị hấp thụ ở 532 nm của mẫu ban đầu lên gấp hơn 5 lần so với giá trị hấp thụ của mẫu sau chiết, và làm thay đổi lượng TMP theo tính toán lên gấp 2-5 lần so với lượng TMP thực tế trong mẫu. Theo Ohkawa và cs (9), việc chiết với butanol-pyridine có thể làm giảm độ nhiễu của sucrose có trong mẫu, nhưng dựa trên kết quả thu được, việc chiết này chỉ đảm bảo giá trị hấp thụ không đổi khi nồng độ sucrose trong mẫu nhỏ hơn 10 mM. Với các mẫu có chứa lớn hơn 20 mM sucrose, phương pháp chiết này không đem lại hiệu quả làm giảm nhiễu do sucrose.

Bảng 1: Ảnh hưởng của các thành phần trong môi trường tới hiệu suất phản ứng

Các chất bổ sung (mM)	Lượng TMP theo tính toán (nmol)
Các chất bổ sung (mM)	Mẫu ban đầu	Sau chiết với butanol-pyridine
Không	4.0	4.0
Sucrose^a
1	5.18 ± 0.91	4.40 ± 0.56
10	8.27 ± 0.54*	5.04 ± 0.42*
20	11.92 ± 0.51*	6.40 ± 0.60*
40	15.48 ± 1.26*	6.92 ± 0.60*
80	19.34 ± 1.30*	8.72 ± 0.60*
100	20.34 ± 1.50*	8.86 ± 0.67*
Mops
1	3.76 ± 0.21	3.74 ± 0.28
10	4.08 ± 0.15	3.46 ± 0.33
20	3.82 ± 0.14	3.58 ± 0.26
Tris-maleate
1	3.84 ± 0.12	3.76 ± 0.43
10	4.21 ± 0.12	3.62 ± 0.22
20	4.02 ± 0.19	4.32 ± 0.46
40	4.02 ± 0.24	3.84 ± 0.24
Phosphate
1	3.94 ± 0.21	3.90 ± 0.22
5	4.06 ± 0.29	3.42 ± 0.24
10	3.82 ± 0.18	4.18 ± 0.43
Imidazole
1	3.94 ± 0.13	3.92 ± 0.29
10	3.98 ± 0.17	4.40 ± 0.63
20	4.00 ± 0.19	3.64 ± 0.23
Chú ý: Quy trình đo quang phổ được mô tả bởi Ohkawa và cs (9) với nồng độ TMP chuẩn là 4 nmol trong tổng thể tích 4 ml, mẫu trắng là mẫu là mẫu chứa đầy đủ các thành phần, ngoài trừ thành phần được kiểm tra ^a nồng độ milimole trong dung dịch cuối cùng, và dấu * thể hiện sự khac biệt có ý nghĩa thống kê (p<0.05) so với mẫu chuẩn 4 nmol không chứa các thành phần gây nhiễu.

Thời gian ủ và nhiệt độ ủ có thể làm thay đổi độ nhiễu do sucrose. Chúng tôi thấy rằng, khi ủ ở 95^oC trong hơn 70 phút, mẫu có giá trị hấp thụ lớn hơn khi được ủ ở 89^oC trong 60 phút. Tuy nhiên, chúng tôi không chú trọng đánh giá sự tác động của thời gian và nhiệt độ ủ lên hiệu suất phản ứng, thay vào đó, các yếu tố này cần được kiểm soát để có thể đánh giá được độ nhiễu do sự thay đổi lượng sucrose.

Hình 1 thể hiện tương quan giữa giá trị hấp thụ tại 532 nm và nồng độ TMP. Khi không có hoặc có 20 mM sucrose, chúng tôi luôn ghi nhận mối tương quan tuyến tính giữa giá trị hấp thụ ở nồng độ TMP khi lượng TMP dưới 10 nmol. Trong môi trường không có sucrose, đường chuẩn của pha ưa nước và dịch chiết organic có giá trị r lần lượt là 0.961 và 0.944, nhưng bằng phân tích hồi quy, độ dốc của đường chuẩn có sự khác biệt mang ý nghĩa thống kê (p<0.001). Hơn nữa, cùng với phân tích hồi quy, đường chuẩn của pha ưa nước gần như đi qua điểm O.

Hình 1: Đường chuẩn TMP trong pha ưa nước và dịch chiết butanol-pyridine.

Tác dụng của sucrose lên dung dịch chuẩn khi chiết organic

Khi bổ sung sucrose, chúng tôi thấy rằng, giá trị hấp thụ của mẫu chuẩn khi chưa chiết có quan hệ tuyến tính với lượng TMP (r=0.900), mặc dù đường này không đi qua điểm O. Các đường tuyến tình này có độ dốc khác với các đường tuyến tính của các dung dịch không chứa sucrose với p<0.02.

Đối với mẫu chuẩn đã chiết với butanol-pyridine, chúng tôi cũng thu được quan hệ tuyến tính giữa giá trị hấp thụ và lượng TMP (r=0.944) và đường tuyến tính này đi qua gốc tọa độ. Khác với mẫu không chiết, độ dốc của đường tuyến tình này không khác biệt với đường tuyền tính của nhóm không chuẩn đã chiết nhưng không chứa sucrose.

Phổ hấp thụ của dung dịch chứa và không chứa TMP, sucrose

Phổ hấp thụ của mẫu trắng và chuẩn TMP chứa/không chứa sucrose (10-80 mM) được đo bằng hệ thống quang phổ Cary Model 219. Trên hình 2, đường là A là phổ hấp thụ của mẫu chuẩn TMP 4 nmol (không chiết) sau khi phản ứng với TBA, đường B là phổ của kết quả phản ứng của 25 mM sucrose với TBA mà không có TMP, và C là phổ của mẫu chứa 4 nmol TMP và 25 mM sucrose sau khi phản ứng với TBA. Mẫu TMP có một đỉnh hấp thụ tại vùng 531-532 nm, trong khi đó, mẫu chỉ chứa sucrose thì lại có đỉnh hấp thụ ở vùng 516-517 nm, nhưng cũng hấp thụ ở 532 nm. Ở mẫu chứa cả TMP và sucrose, ghi nhận đỉnh hấp thụ tịa 520 nm với giá trị hấp thụ cao gần như gấp đôi các mẫu khác.

Hình 2: Phổ háp thụ của các mẫu (A) chỉ chứa TMP 4 nmol, (B) chỉ chứa sucrose 25 mM, (C) chứa TMP bổ sung sucrose. Các đường D và E là dịch nghiền đồng thể mô gan trong KCL vả phản ứng với SDS, acetic acid mà không có TBA và TMP.

Khi chiết 4 ml hỗn hợp sau phản ứng của mẫu chỉ chứa TMP với 5ml butanol-pyridine, đỉnh hấp thụ của TMP có sự dịch chuyển nhẹ sang vùng 532-534 nm (Hình 3A). Đối với mẫu chứa sucrose nhưng không chứa TMP, giá trị hấp thụ ở vùng sau 500 nm bị giảm mạnh và chỉ xuất hiện đỉnh ở 450 nm. Mẫu chứa 4 nmol TMP và 25 mM sucrose (Hình 3C) có đỉnh hấp thụ ở 532-533 nm và đỉnh hấp thụ này cao hơn hẳn so với mẫu TMP không chứa sucrose, kết quả này cho thấy, chỉ chiết organic không đủ khả năng khử nhiễu do sucrose. Tuy nhiên, khi xác định giá trị hấp thụ ở vùng 532-533 nm của các mẫu TMP-sucrose một lần nữa với mẫu trắng chỉ chứa sucrose, kết quả ghi nhận, mẫu TMP không chứa sucrose có giá trị hấp thụ cao nhất (Hình 3A), điều này cho thấy, phương pháp sau khi tối ưu đã làm giảm nhiễu, tuy nhiên, vẫn xuất hiện định hấp thụ 450 nm.

Hình 3: Phổ hấp thụ của các mẫu như hình 2 nhưng được chiết với butanol-pyridine.

Đánh giá quy trình đã tối ưu

Quy trình sau tối ưu cho phép chúng tôi xác định được lượng TMP đã thêm vào trong dịch nghiền đồng thể của mẫu mô bảo quản trong 0.25 M sucrose. Sự khác biệt về khả năng hấp thụ giữa dịch nghiền đồng thể thêm TMP và không thêm TMP được tính dựa trên đường chuẩn TMP và so sánh với lượng TMP đã cho vào (4 nmol) bằng phân tích khi bình phương. Ví dụ, 200 µl dịch nghiền đồng thể mô gan chứa 5.28 ± 0.62 nmol chất phản ứng với TBA (N=11, giá trị trung bình ± SE). Khác biệt trung bình giữa các mẫu này khi bổ sung 4 nmol TMP là 4.08 nmol (số liệu thu được từ 11 mẫu, mỗi mẫu 3 lần đo). Giá trị hấp thụ từ các mẫu có độ khác biệt lên đến 1.9%, tuy nhiên khi sử dụng phân tích khi bình phương, sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê (p<0.25). Kết quả này cũng tương tự khi làm với mô tim, phổi và cơ.

Ảnh hưởng của sucrose trong mẫu chuẩn và các mẫu sinh học

Khi sử dụng quy trình đã tối ưu lên mẫu sinh học, một vấn đề là các mẫu này thường chứa một lượng lớn nước và đường trong mẫu, các chất này thường có nồng độ thấp hơn so với môi trường phản ứng. Hơn nữa, nếu thể tích của môi trường khi chưa có mẫu bằng với thể tích mẫu sinh học được sử dụng thì nồng độ sucrose cuối sẽ cao hơn trong dịch nghiền đồng thể. Vì mỗi mẫu có thường có chứa sucrose dù với lượng nhỏ nhưng cũng đủ gây nhiễu tới kết quả định lượng các chất phản ứng với TBA. Ví dụ, khi nghiền đồng thể 1g mô (trong mua có 80% là nước) trong 9 ml dung dịch chứa 0.25 M sucrose để tạo thành dung dịch cuối có lượng sucrose là 0.23 M. Sự chênh lệch này đồng nghĩa với việc, khi sử dụng dịch nghiền đồng thể này trong thí nghiệm với mẫu trắng và chuẩn chứa 0.25 M sucrose. Chúng tôi cho rằng để làm giảm sự chênh lệch này không đơn thuần chỉ bằng cách bổ sung môi trường chứa sucrose và không chứa mẫu và mẫu trắng và chuẩn, mà cần bổ sung nước.

Chuẩn TMP (4 nmol, N=10) và mẫu trắng có chứa 22 mM sucrose (nồng độ cuối). Để tạo sự tương đồng với mẫu sinh học, 4 nmol TMP chuẩn sẽ chứa ít hơn 10-30% sucrose (20, 18 và 15 mM). Giá trị hấp thụ của các mẫu được đo ở 532 nm với mẫu trắng chứa 22 mM sucrose. Giá trị hấp thụ và lượng TMP được tính toán và so sánh với mẫu TMP chuẩn chứa 22 mM sucrose. Kết quả cho thấy, theo tính toán, lượng TMP thực tế đo được khi pha với 22 mM sucrose là 3.96 ± 0.1 nmol (giá trị trung bình ± SE), lệch 1.0% so với giá trị lý thuyết là 4.00 nmol, đối với các mẫu chứa 18 mM và 15 mM sucrose, giá trị này lần lượt là 4.00 ± 0.10 nmol (không lệch so với lý thuyết) và 3.94 ± 0.04 nmol (lệch 1.4% so với lý thuyết). Do đó, nếu trong mẫu không chứa quá nhiều nước, có thể không cần pha loãng sucrose với nước.

Tuy nhiên, vẫn sẽ có trường hợp mẫu sinh học có chứa lượng sucrose cuối cùng lớn hơn mẫu trắng và chuẩn, từ đó dẫn đến sai lệch trong tính toán lượng chất phản ứng với TBA trong mẫu sinh học. Cũng bằng phương pháp so sánh như trên, chúng tôi đã chuẩn bị chuẩn TMP 4 nmol trong các ông nghiệm chứa một lượng sucrose để khi kết thúc, lượng sucrose cuối cùng đạt 24 và 26 mM, và xác định lượng TMP thực tế đo được với mẫu trắng chứa 22 mM sucrose. Lượng TMP thực tế đo được trong mẫu chứa 24 mM sucrose là 4.06 ± 0.05 nmol (cao hơn lý thuyết 1.3%0, trong khi mẫu chứa 24 mM sucrose, lượng TMP thực tế đo được là 4.19 ± 0.04 nmol (cao hơn lý thuyết tới 4.7%). Do đó, quy trình mà chúng tôi đã tối ưu vẫn có thể có các lỗi này, mặc dù độ sai khác so với lý thuyết không lớn.

Ảnh hưởng của KCl và sucrose trong môi trường nghiền đồng thể

Chúng tôi đã tiến hành so sánh sự ảnh hưởng của KCl (9) và sucrose trong môi trường nghiền đồng thể. Mẫu chứa sucose có nồng độ sucrose cuối cùng trong khoảng từ 11.5 mM (200 µl mẫu và giả sử có chứa 80% nước) tới 22.5 mM (400 µl mẫu). Lượng chất phản ứng với TBA trong 200, 300, và 400 µl mẫu nghiền với KCl được chiết với butanol- pyridine lần lượt là 2.22 ± 0.20, 3.36 ± 0.32, và 4.54 ± 0.35 nmol (giá trị trung bình ± SE, N= 9). Giá trị hấp thụ của các mẫu được nghiền trong sucrose, chiết lần lượt là 2.19 ± 0.06, 3.46 ± 0.19 và 4.44 ± 0.20 nmol. Bằng so sánh t test, giá trị hấp thụ của mẫu nghiền với KCl và sucrose không có sự khác biệt. Khi lượng chất phản ứng với TBA được tính dựa trên lượng protein của mẫu (Biuret), khả năng hấp thụ trung bình của 200, 300 và 400 µl mẫu nghiền với sucrose là 0.49 ± 0.02 nmol/mg, và với các mẫu nghiền với KCl là 0.51 ± 0.02 nmol/mg (không có sự khác biệt mang ý nghĩa thống kê). Độ dốc của các đường hồi quy giữa thể tích mẫu và lượng chất phản ứng với TBA cũng không có sự khác biệt giữa hai nhóm mẫu. Tương tự, cũng không có sự khác biệt mang ý nghĩa thống kê về khả năng hấp thụ khi chuẩn TMP được pha với sucrose và KCl.

Phổ hấp thụ của mẫu gan nghiền với KCl và ủ 60 phút, 95^oC trong SDS, acetic acid và sucrose được biểu diễn ở Hình 2. Thí nghiệm này nhằm xác định nồng đồ sucrose cho đỉnh hấp thụ gần với đỉnh hấp thụ của mẫu TBA-TMP nhất. Từ hình 2, giá trị hấp thụ của mẫu tại 532 rất thấp. Ngoài ra, ở tất cả các bước sóng trong phổ hấp thụ, không có sự khác biệt giữa giá trị hấp thụ của mẫu mô nghiền với sucrose và không với sucrose (Hình 2D và 2E). Bên cạnh đó, giá trị hấp thụ của các mẫu này sau khi chiết với butanol-pyridine đều giảm mạnh (Hình 3D và 3E). Kết quả này cho thấy, sucrose không phản ứng với các thành phần của mô gan và không ảnh hưởng tới lượng chất phản ứng với TBA trong mẫu

Thảo luận

Ở các thí nghiệm trên lượng mẫu nhỏ và được bảo quản với 0.25 M sucrose, thì dù với một lượng nhỏ sucrose cũng có thể gây nhiễu kết quả phân tích. Có thể thấy rằng, khi thể tích mẫu lớn, đủ để đánh giá quá trình peroxide hóa lipid trong mẫu, có thể có lượng sucrose cuối cùng có thể lớn hơn 20 mM. Môi trường chứa lượng sucrose cao hơn 0.25 M thường được dùng trong ly tâm, đây là điều kiện để gây ra các tín hiệu nhiễu trong kết quả. Từ dữ liệu thu được, khi 400 µl mẫu được nghiền đồng thể với 0.25 M sucrose, quy trình đã tối ưu của chúng tôi có thể xác định chính xác lượng TMP trong chuẩn.

Vấn đề nhiễu trong thí nghiệm phản ứng TBA không phải là một vấn đề mới mẻ. Baumgartner và cs (2) đã chứng minh tương tác giữa TBA và 30 mM sucrose (90 µmol trong 3 ml) sẽ thay đổi phụ thuộc vào điều kiện thí nghiệm, và rất nhiều yếu tố có thể tác động tới phản ứng. Ở các mẫu không có TMP, dù có chứa sucrose nhưng không ghi nhận đỉnh hấp thụ ở 532 nm, điều này cho thấy sucrose không tạo ra sản phẩm có màu tương tự như malonaldehyde trong phản ứng. Với đỉnh hấp thụ của nhóm này ở 440 nm, có thể đã có sự hình thành hydroxymethylfurfural khi nhiệt phân (2). Tuy nhiên, đỉnh hấp thụ 450 nm chỉ xuất hiện ở các mẫu chữa sucrose và được chiết organic. Mặc dù theo nhiều nghiên cứu, phản ứng với TBA và malonaldehyde không phụ thuộc nhiều vào nhiệt độ và acid (11) nhưng trong nhiều protocol, nhiều nhóm vẫn để phản ứng trong điều kiện nhiệt độ cao, khoảng 100^oC. Ohkawa và cs (9) khi tối ưu phản ứng TBA đã kết luận rằng mức nhiệt 95^oC trong 60 phút không là cần thiết để phản ứng tạo màu.

Buttkus và Bose (7) cũng ghi nhận malonaldehyde có thể phản ứng với các chất phi aldehyde, từ đó làm giảm lượng malonaldehyde tham gia phản ứng với TBA, Tuy nhiên, trong điều kiện phản ứng chứa sucrose, rõ ràng đã xuất hiện nhiễu trong kết quả định lượng các chất phản ứng với TBA. Baumgartner và cs (2) và Marcuse và Johansson (6) cũng báo cáo về phản ứng của TBA với các aldehyde nhưng trong một số điều kiện, điều này không ảnh hưởng tới kết quả định lượng malonaldehyde trong mẫu sinh học. Theo lý thuyết, mẫu acetaldehyde có bổ sung sucrose cũng có đỉnh hấp thụ ở 532 nm giống như malonaldehyde, nhưng trong nghiên cứu này, chúng tôi không ghi nhận đỉnh hấp thụ 532 nm ở mẫu không chứa TMP, như vậy, nhiễu do sucrose-acetaldehyde không xảy ra trong thí nghiệm này. Trong một số mẫu, xuất hiện các đỉnh ở 450 nm, đây có thể là các sản phẩm phân hủy của TBA (11).

Mặc dù sucrose có thể gây nhiễu, nhưng chúng tôi đã tiến hành phân tích nhằm xây dựng quy trình tối ưu cho mẫu sinh học có thể tích nhỏ.

Tài liệu tham khảo

Buege JA and Aust SD (1978) in Methods in Enzymology (Fleischer S and Packer L eds.) Vol. 53. pp. 302-3 10. Academic Press. New York.
Baumgartner WA, Baker N, Hill VA and Wright ET (1975) Lipids 10, 309-3 I I.
Guttetidge JMC and Tinker TR (1978) Biochem. Med. 19, 127- 132.
Bird RP, Hung SO, Hadley M and Draper HH (1983) Anal. Biochem. 128, 240-244.
Gray JI (1978) J. Amer. Oil Chem. Soc. 55, 539- 546.
Marcuse R and Johansson L (1973) J. Amer. Oil Chem. Soc. 50, 387-391.
Buttkus H and Bose RJ (1972) J. Amer. Oil Chem. Soc. 47, 440-443.
Ohkawa H, Ohishi N and Yagi K (1978) J. Lipid Res. 19, 1053-1057.
Ohkawa H, Ohishi N and Yagi. K (1979) Anal. Biochem. 95, 35l-358.
Dahle LK, Hill EG and Holman RT (1962) Arch. Biochem. Biophys. 98, 253-261.
Tarladgis BG, Pearson AM and Dugan LR Jr. (1964) J. Sci. Agric. 15, 602-607.
Mihara M, Uchiyama M and Fukuzawa K (1980) Biochem. Med. 23, 302-311.