Tác dụng chống viêm thông qua điều hòa lượng Nitric oxide của dịch chiết ethanol Piper betle Linn.

Ganguly S1, Mula S, Chattopadhyay S, Chatterjee M. (2007): “An ethanol extract of Piper betle Linn. mediates its anti-inflammatory activity via down-regulation of nitric oxide”, J Pharm Pharmacol.; 59(5):711-8

Link bài gốc: https://drive.google.com/open?id=1HhKaD4nFK3DxjCBLnaK1CWsuZgVFuLsR 

Biên dịch: Phạm Ngọc Sơn                      
                                                     

Tóm tắt  

Lá của cây Piper betle (lá trầu không) được sử dụng khá phổ biến ở Ấn Độ trong giảm đau, tuy nhiên, cơ chế phân tử của tác dụng dược lý này vẫn chưa được làm sáng tỏ. Tác dụng chống viêm và điều biến miễn dịch của dịch chiết ethanol lá P.betle (100 mg/kg; PB) được chứng minh trên mô hình chuột viêm khớp với tá chất Freund, với dexamethasone (0.1 mg/kg) được sử dụng làm đối chứng. Ở liều lượng không độc (5-25 µg/mL), bằng các kỹ thuật định lượng nitric oxide như Griess và flow cytometry với đầu dò đặc hiệu 4,5-diaminofluorescein-2 diacetate, ghi nhận sự thay đổi lượng NO theo liều lượng PB sử dụng trên đối tượng đại thực bào. Việc giảm sản xuất gốc tự do chứa nito ở đại thực bào có thể do PB đã tham gia điều hòa làm giảm biểu hiện của enzyme nitric oxide synthase, và kèm theo đó là giảm biểu hiện của interleukin-12 p40, kết quả này cho thấy khả năng điều hòa của PB đối với các đáp ứng viêm của tế bào T-helper 1. Tóm lại, tác dụng chống viêm và chống viêm khớp của PB là do khả năng điều hòa hoạt động sản xuất gốc tự do chứa nito, từ đó mở ra các hướng phát triển dược học mới.

Giới thiệu

Viêm là đáp ứng của mạch máu và các yếu tố hỗ trợ của mô đối với các thương tổn, đáp ứng này dẫn đến sự tăng tiết các sản phẩm giàu protein với điều kiện thương tổn không phá hủy mô (Majno & Joris 1996). Đáp ứng viêm dẫn đến sự di chuyển của thể dịch và bạch cầu từ máu vào trong các mô ngoại mạch, hoạt động này được điều hòa bởi rất nhiều các chất trung gian như cytokine, eicosanoid, nitric oxide (NO) và gốc tự do chứa oxi, và do bạch cầu lympho, đại thực bào và các tế bào miễn dịch khác phụ trách (Korhonen và cs 2005).

Việc sử dụng các thuốc chống viêm trong thời gian dài có thể dẫn tới nhiều tác dụng phụ không mong muốn. Do đó, các sản phẩm tự dược liệu thiên nhiên đang là một lựa chọn mới, rẻ hơn, có khả năng ứng dụng cao và ít độc hơn. Piper betle Linn. (thuộc họ Piperaceae) được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền không chỉ ở Ấn Độ mà còn ở nhiều quốc gia Nam Á khác. Cây thường được gọi là “Trầu không”, lá hoặc dịch chiết lá của cây thường được sử dụng làm thuốc chữa viêm miệng, chữa ho, chất làm se da, chất khử trùng, chất kích thích, thuốc bổ, thuốc long đờm, thuốc đánh răng và ức chế ức chế chảy máu mũi (Nadkarni 1976). Ngoài ra, theo một số tài liệu, cây cũng được sử dụng để chữa sưng phù, chữa đau mắt (Nadkarni 1976). Các nghiên cứu hiện đại đã ghi nhạn, P.betle có khả năng kháng khuẩn (Shitut và cs 1999), chống đông máu (Sarkar và cs 200), chống viêm loét (Majumdar và cs 2002), ức chế tiểu cầu (Jeng và cs 2002) và giảm stress do bức xạ (Choudhary & Kale 2002, Bhatacharya và cs 2005), và chống tiểu đường (Santhakumari và cs 2003).

Tuy nhiên, vẫn chưa có nghiên cứu nào chứng minh khả năng chống viêm của P.betle. Trong nghiên cứu này, nhóm sẽ đánh giá khả năng chống viêm của dịch chiết ethanol lá P.betle Linn. trên mô hình chuột bị viêm mãn tính. Trong mô hình này, enzyme Nitric oxide synthase (iNOS) có khả năng tạo ra lượng NO cao gấp 1000 lần để đáp ứng với các kích ứng khác nhau, đây là một trong các biểu hiện của bệnh rối loạn viêm nhiễm như viêm khớp dạng thấp (MacMicking và cs 1997). Interleukin-12 (IL12) là một heterodimeric cytokine do đại thực bào và các tế bào tua tiết ra dưới sự kích thích của vi khuẩn, protein này có liên quan đến các bệnh rỗi loạn viêm mãn tính do T-helper 1 (Th1) gây ra như viêm khớp, các bệnh viêm ruột (Adorini 1999).

Vật liệu và phương pháp

Hóa chất

N-1 naphthyl ethylene diamine dihydrochloride được cung cấp bởi công ty Loba Chemie Pvt (Mumbai, Ấn Độ). Sulfanilamide và phenazine methosulfate được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Sisco Research Laboratories (Mumbai, Ấn Độ). Tá chất Freund hoàn chỉnh, RPMI-1640 phenol-red-free powdered medium, 4,5-diaminofluorescein diacetate (DAF-2 DA), lipopolysaccharide (LPS) và N-monomethyl arginine được mua từ Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA). 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium, MTS do công ty Promega (Madison, WI, USA) cung cấp. Bộ kít RNAqueous kit được cung cấp bởi Ambion (Austin, TX, USA) và bộ kít OneStep RT-PCR kit do Qiagen (Hilden, Đức) cung cấp. Các cặp mồi được đặt mua từ Sigma Genosys (St. Louis, MO, USA).

Chuẩn bị dịch chiết

Lá P.betle tươi được thu thập và xác định bởi Trung tâm mẫu cây quốc gia Trung ương, Khảo sát thực vật của Ấn Độ (Shibpur, Howrah, Ấn Độ). Sau khi sấy khô và tán nhỏ thành bột, bột lá (300g) được chiết 2 lần với ethanol tuyệt đối (900mL mỗi lần) và lọc dịch thu được được tái hòa tan bằng bộ chưng cất Soxhlet (Bhattacharya và cs 2005). Dịch chiết được ký hiệu là PB và được sấy khô, bảo quản lạnh, cao thu được có khối lượng 3.63g. Trong mỗi thí nghiệm, cao được hòa tan bằng propylene glycol.

Xác định các thành phần thực vật trong PB

PB được hòa tan trong methanol (50mL), và được xử lý với charcoal (0.2g), lắc đều và ủ ở nhiệt độ ~60^oC. Sau khi lọc, dịch chiết được cô và làm lạnh để thu được kết tinh không chứa chlorophyl, có màu nâu vàng, dạng rắn (1.29% w/w).

Các thành phần của PB được xác định bằng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) model PU-2080 plus với cột Hypersil GOLD (250x4.6mm, kích thước hạt 5µm) do hang Thermo Electron (Waltham, MA, USA) cung cấp, dung môi gồm acetonitrile/nước (1:1, tốc độ dòng 0.5mL/phút), đỉnh thu được ở 254nm.

Động vật thí nghiệm

Nghiên cứu được tiến hành trên đối tượng chuột Sprague-Dawley đực (120-150 g). Chuột được nuôi ở bộ phận nuôi động vật trong điều kiện nhiệt độ tiêu chuẩn (25±5^oC) và duy trì chu kỳ sáng 12 h/ngày. Động vật được ăn thức ăn dạng hạt và uống nước đầy đủ. Chuột được nuôi ổn định trong 1 tuần trước khi tiến hành thí nghiệm. Quy trình thí nghiệm đáp ứng đầy đủ các yêu cầu từ hội đồng đạo đức trong nghiên cứu trên động vật.

Kiểm tra tình trạng viêm của chuột theo mô hình gây viêm khớp bằng tá chất Freund

Chuột được chia thành 3 nhóm, mỗi nhóm gồm 8 con. Chúng được gây viêm khớp bằng cách tiêm 0.1 mL tá chất Freund vào khu vực bàn chân sau (Newbould 1963). Từ ngày 1 đến 13, chuột được uống 0.5 mL PB với liều 100 mg/kg hoặc 0.5mL dexamethasone với liều 0.1mg/kg, nhóm được uống dexamethasone được xem là nhóm tham chiếu chuẩn, nhóm chuột đối chứng được uống 0.5mL propylene glycol. Ở các ngày 3, 5, 9. 13 và 21, bằng phương pháp đo độ phòng, xuất hiện hiện tượng sưng phù ở cả 2 chi sau của chuột. Tỷ lệ ức chế sưng được tính bằng công thức của Tsao & Linn 1999: (V_c - V_t) / V_c x 100, trong đó, V_c­ và V_t­ là thể tích sưng của nhóm đối chứng và nhóm thử thuốc. Ở ngày 21, chuột được đo các chỉ số viêm khớp (bảng 1) và tính tổng điểm từng con (Schorlemmer và cs 1999).

Bảng 1: Điểm viêm khớp

Vị trí	Mô tả	Điểm
Tai	Không có các nốt đỏ	0
	Có các nốt đỏ	1
Mũi	Mô liên kết bị phồng	0
	Mô liên kết không bị phồng	1
Đuôi	Không có nốt	0
	Có nốt	1
Bàn chân trước	Không viêm	0
	Viêm	1
Bàn chân sau	Không viêm	0
	Viêm nhẹ	1
	Viêm trung bình	2
	Viêm	3

Thu đại thực bào

Các tổn thương cơ bản được đánh giá bằng cách, đầu tiên, tính phần trăm ức chế tăng thể tích chân trái (chân được tiêm) ở ngày 5. Tiếp theo, tỷ lệ ức chế tăng thể tích chân phải (chân không tiêm) ở ngày 21. Cuối cùng, tổng phần trăm các thay đổi được tính bằng cách: phần trăm ức chế chân được tiêm ở ngày 5 + phần trăm ức chế chân không tiêm ở ngày 21 + phần trăm thay đổi các chỉ số viêm khớp (Schorlemmer và cs 1999).

Chuột được uống 1 mL thioglycollate (4% pha trong 0.02 M đệm phosphate (PBS) pH 7.2). Sau 96 h, đại thực bào ở phúc mạc được thu bằng cách rửa với 10 mL môi trường RPMI-1640 không phenol. Dịch màng được ly tâm 300g trong 10 phút, sau khi rửa 2 lần với môi trường trên, tế bào được nuôi trong môi trường RPMI-1640 không phenol, có bổ sung 10% huyết thanh bò, penicillin (50 U/mL) và streptomycin (50 mg/mL), đây là môi trường A. Đại thực bào sống (với tỷ lệ >95% khi nhuộm với Typan blue) được giữ ở nhiệt độ 37^oC, 5% CO₂.

Xác định lượng NO của đại thực bào

Đại thực bào thu được từ phúc mạc được nuôi trong môi trường A trên khay nuôi cấy 12 giếng (2.5x10⁶ tế bào/mL/giếng) và ủ ở 37^oC, 5% CO₂ trong 3 giờ. Đai thực bào được ủ với LPS (10 µg/mL) trong điều kiện có hoặc hông có PB (0-25 µg/mL) ở 37^oC, 5% CO₂ trong 48 giờ nữa. Lượng NO tạo ra được xác định bằng thí nghiệm Griess (Sarkar và vs 2005). Theo đó, 0.5mL chất thử Griess (gồm naphthylethylenediamine dihydrochloride (0.1% pha trong nước) và sulfanilamide (1% pha trong 5% phosphoric acid) theo tỷ lệ 1:1) được bổ sung vào 0.5 mL môi trường nuôi cấy, ủ hỗn hợp trong tối, ở nhiệt độ 25-30^oC trong 10 phút. Hỗn hợp được đo quang phổ ở bước sóng 546 nm, đường chuẩn được xây dựng với natri nitrite nồng độ từ 0-100 µM. Để xác định độ đặc hiệu, đại thực bào được ủ với LPS (10 µg/mL) và N-monomethyl arginine (L-NMMA, 100 mM) nhằm ức chế NO mới được tạo ra (Olken & Marletta 1993).

Đánh giá khả năng sống của đại thực bào

Đại thực bào (2x10⁵ tế bào/200µL/giếng) được ủ ở 37^oC, 5% CO₂ trong 3 giờ, sau đó, tế bào tiếp tục được ủ với PB (0-100 µg/mL) hoặc proplene glycol (2% v/v) và ủ trong 37^oC, 5% CO­₂ trong 48 giờ nữa. Sau khi kết thúc, bổ sung vào các giếng 20 µL hỗn hợp 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium, muối lưỡng cực (2 mg/mL trong PBS, MTS) và phenazine methosulphate (0.92 mg/mL trong PBS) (pha với tỷ lệ 10:1) rồi ủ tiếp ở 37^oC trong 3 giờ (Ganguly và cs 2006). Tỷ lệ sống của tế bào được tính dựa trên thương số giữa giá trị thấp thụ tại 490 nm của môi trường thử và giá trị hấp thụ tại 490 nm của môi trường đối chứng (chỉ chứa môi trường và thuốc/dung môi): (giá trị hấp thụ của môi trường thử / giá trị hấp thụ của môi trường đối chứng) x 100.

Xác định lượng NO nội bào bằng flow cytometry

Đại thực bào thu được sẽ được nuôi trên khay nuôi cấy 6 giếng (1x10⁶ tế bào/mL/giếng) và ủ ở 37^oC, 5% CO₂ trong 1 giờ. Để kích thích tế bào sinh NO, LPS (10 µg/mL) vào mỗi giống, sau đó thêm PB (25 µg/mL) và NMMA (100 µM) vào giếng và tiếp tục ủ trong 24 giờ ở 37^oC, 5% CO₂. Sau khi loại bỏ môi trường, tế bào được ủ với DAF-2 DA (10 µM) trong 30 phút ở 37^oC, 5% CO­₂. Phản ứng kết thúc khi tế bào bị làm lạnh, làm tế bào rời ra bằng cách chà nhẹ, sau đó bổ sung 1 µg/mL propidium iodine (PI) và ủ tiếp ở 20-25^oC trong 10 phút. Các tế bào được chạy qua hệ thống flow cytometer (FACS Calibur, BD Bioscatics, San Jose, CA, USA) và sử dụng tán xạ trước và tán xạ bên để phân biệt các đại thực bào, tán xạ bên FL2 sẽ phân tách các đại thực bào sống (PI âm) và các đại thực bào không sống (PI dương), và lập biểu đồ FL1 để định lượng đại thực bào sống. Các phân tích được thực hiện trên phần mềm BD Cell Quest Pro.

Phân tích bằng phản ứng PCR phiên mã ngược (RT-PCR)

Đại thực bào (1x10⁷/5 mL) được nuôi cấy trên đĩa Petri 90 mm và ủ với PBS hoặc hỗn hợp PBS và PB (2.5-25 µg/mL) hoặc PG (0.5% v/v). Sau khi ủ 24 giờ, RNA tổng số được tách bằng bộ kít RNAqueous (Ambion, Inc., Austin, TX, USA). 100 ng sản phẩm thu được sẽ được chạy RT-PCR với bộ kít OneStep RT-PCR. Bằng phản ứng này, RNA sẽ được phiên mã ngược thành cDNA, và có thể sử dụng trong các thí nghiệm kế tiếp với các cặp mồi đặc hiệu cho các gene:

β-actin      sense: 5′- TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC-3'

                 anti-sense: 5′-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3′)

iNOS        sense: 5′ CATGGCTTGCCCCTGGAAGTTTCTCTTCAAAG-3′

                 anti-sense: 5′ GCAGCATCCCCTCTGATGGTGCCATCG-3′

IL-12 p40 sense: 5′ CAGAAGCTAACCATCTCCTGGTTTG-3′

                 anti-sense: 5′- TCCGGAGTAATTTGGTGCTTCACAC-3′)

Theo quy trình của nhà sản xuất, trong phản ứng phiên mã ngược, các mẫu được ủ ở 50^oC trong 30 phút và hoạt hóa tiền PCR ở 95^oC trong 15 phút. Đối với phân tích NOS, mẫu được chạy PCR 36 chu kỳ, cụ thể: biến tính (94^oC, 1 phút), gắn mồi (54^oC, 1 phút) và kéo dài (72^oC, 90 giây) (Portugal vav cs 2004). Trong khi đó, đối với phân tích β-actin và IL-12 p40, chu trình nhiệt được sử dụng là: biến tính (94^oC, 30 giây), gắn mồi (58^oC, 45 giây) và kéo dài (72^oC, 30 giây) (Kim và cs 2003). Sau khi chạy bước cuối 72^oC, 10 phút, sản phẩm RT-PCR được đem đi điện di trên gel agarose (1.5%) chứa 0.5µg/mL ethidium bromide và quan sát bằng hệ thống Molecular Imager ChemiDoc XRS System (Bio Rad, CA, USA). iNOS và IL-12 được phân tích định lượng bằng phần mềm TotalLab Nonlinear Dynamic Image Analysis (Nonlinear USA Inc., Durham, NC, USA).

Xử lý số liệu

Kết quả được biểu diễn dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (SD). Số liệu được phân tích bằng phân tích Kruskal-Wallis và Mann- Whitney U-test. Để phân tích mối tương quan giữa thời gian và quá trình sưng, chúng tôi sử dụng phân tích Friedman và Wilcoxon’s matched pairs signed rank test. So sánh Tukey được sử dụng để phân tích tác dộng của nồng độ tới khả năng sống của tế bào. Sự khác biệt được xem là có ý nghĩa thống kê khi p<0.05.

Kết quả

4 thành phần chính của PB được xác định bằng  kỹ thuật HPLC. Bằng cách so sánh với thời gian lưu của chất chuẩn, 4 thành phần của PB được xác định là chevibetol (0.35%), allylpyrocatechol (0.41%) và các glycoside của chúng (0.021% và 0.047%) (Hình 1). Trong đó, thời gian lưu của allylpyrocatechol glycosides, chevibetol glycosides, allylpyrocatechol và chevibetol lần lượt là 6.7 phút, 9.5 phút, 19.1 phút và 23.7 phút.

Trên mô hình động vật bị viêm khớp mãn tính, PB cho thấy khả năng chống viêm tốt và khả năng chống viêm khớp ở mức độ trung bình. PB cũng làm giảm sưng ở chân trái (chân tiêm) ở ngày 5 (p<0.05), khi so sánh với đối chứng (Bảng 2). Ở ngày 5, đây là ngày xác định khả năng chống viêm do tá chất ở chân được tiêm, PB (100 mg/kg) làm giảm kích thước sưng xuống 24.73%, p<0.05; trong khi đó, nhóm chuột uống dexamethasone (0.1 mg/kg), kích thước sưng giảm xuống 62.37% (p<0.05). Về điểm viêm khớp (Bảng 2) từ ngày 13-21, trung vị điểm viêm khớp của nhóm chuột uống PB chỉ bằng 2/3 so với nhóm chuột đối chứng (p<0.05), và lần lượt là 2.0 và 3.0; nhóm chuột uống dexamethasone có trung vị điểm viêm khớp là 0.5, chỉ bằng 1/6 so với nhóm đối chứng (p<0.05). Theo đó, tổng phần trăm thay đổi của nhóm uống PB là 58.06% (24.73%+0+33.33%), trong khi nhóm uống dexamethasone là 145.7% (62.37%+0+83.33%).

Hình 1: Sắc ký đồ dịch chiết ethanol P.betle (PB)

PB ức chế đại thực bào giải phóng NO. Tác động của PB lên quá trình tổng hợp NO của đại thực bào được kiểm chứng bằng thí nghiệm định lượng NO tích lũy. LPS sẽ kích thích tổng hợp NO, và lượng NO này sẽ giảm tùy theo lượng PN được sử dụng (0-25 µg/mL) (Hình 2). Khi đại thực bào được xử lý với PB liều 15 và 25 µg/mL làm giảm lượng NO xuống lần lượt là 28.57% (p<0.05) và 40% (p<0.05). Để chứng minh tính đặc hiệu của phản ứng, đại thực bào không chỉ được xử lý với LPS mà con được xử lý với L-NMMA, một chất ức chế iNOS. So với nhóm chỉ được xử lý với LPS, nhóm được xử lý với L-NMMA có lượng NO nhỏ hơn 74.29% (p<0.05) (Hình 2).

Hình 2: Lượng NO do đại thực bào sinh ra

PB là giảm lượng NO nội bào của đại thực bào. Để chứng minh rằng, việc NO của đại thực bào giảm là do hiệu quả của PB, nhóm đã tiến hành chạy flow cytometry sử dụng DAF-2 DA, một đầu dò không phát huỳnh quang và được sử dụng để đo NO ở tế bào sống (Tarpey và cs 2004). Trong tế bào, nhóm diacetate bị thủy phân bởi enzyme esterase trong tế bào chất, giải phóng DAF-2 và các chất khác bên trong tế bào. Các sản phẩm nitrosat hóa là dẫn xuất của No như dinitrogen trioxide hay N₂O₃ sẽ được nitrosat hóa và được nhuộm với DAF-2 DA để tạo ra các dẫn xuất triazole, DAF-2T, có khả năng phát huỳnh quang mạnh.

Giá trị huỳnh quang trung bình (Hình 3) chỉ ra rằng, LPS làm tăng lượng NO, trong khi PB (25 µg/ml) làm giảm lượng NO từ 71.83 xuống 12.9, hay giảm 82.04% lượng NO so với LPS. L-NMMA, một chất ức chế iNOS cũng làm giảm lượng NO sinh ra với giá trị huỳnh quang trung bình là 23.3.

Bảng 2: Tác động của dịch chiết ethanol Piper betle lên mô hình viêm mãn tính do tá chất Freund

Nhóm	Trung vị điểm viêm khớp (% thay đổi)	Thể tích sưng (mL) (% ức chế)
		Ngày 3	Ngày 5	Ngày 9	Ngày 13	Ngày 21
Đối chứng	3.0; 3.0-4.0	0.8±0.11	0.93±0.02	0.53±0.09	0.63±0.09	0.5±0.12
PB (100 mg/kg)	2.0*; 1.0-3.0 (33.33%)	0.71±0.18 (11.25%)	0.7±0.18* (24.73%)	0.65±0.15 _	0.61±0.18 (3/17%)	0.56±0.20 _
Dexamethasone (0.1 mg/kg)	0.5*;0.0-1.0 (83.33%)	0.35±0.04 (68.75%)	0.35±0.05 (62.37%)	0.23±0.14 (56.60%)	0.18±0.18 (71.43%)	0.25±0.05 (50.00%)
% thay đổi các điêm viêm khớp được tính dựa trên công thức của Schorlemmer và cs (1999). Kết quả thể tích sưng được biểu diễn dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (SD), n=8. *p<0.05, khác biệt với đối chứng có ý nghĩa thống kê

Hình 3: PB làm giảm lượng NO của đại thực bào

PB (25 µg/mL) không gây độc cho đại thực bào. Lượng NO trong tế bào giảm (Hình 2 và 3) không phải do độc tế bào của PB, của propylene glycol (PG), đại thực bào được ủ với PB (0-100 µg/mL) hoặc PG (0-2% v/v) và được theo dõi khả năng sống. Ghi nhận, ở nồng độ dưới 25 µg/mL, PB không gây độc cho tế bào (Hình 4). PG với nồng độ 0.5% cũng không gây ảnh hưởng tới khả năng sống của tế bào, trong khi đó, khi nồng độ PG tăng lên 1-2% v/v, tế bào giảm tới 80% khả năng sống. Kết quả này cho thấy, việc giảm tạo thành NO trong tế bào không phải do độc tính của PB hay PG.

Hình 4: Tác động của PB lên khả năng sống của đại thực bào

PB làm giảm biểu hiện của iNOS và IL-12 p40. Bằng cách đánh giá biểu hiện iNOS mRNA thông qua RT-PCR, nghiên cứu đã chỉ ra PB là giảm tổng hợp NO. Ở hình 5, khi tế bào được ủ với PB (0-25 µg/mL) và LPS (10 µg/mL) trong 24 giờ đều làm giảm biểu hiện của iNOS (p<0.01), nồng độ PB càng cao càng làm giảm biểu hiện của iNOS.

IL-12, một cytokine dạng heterodimer, tham gia vào quá trình hình thành bệnh của rất nhiều các bệnh rối loạn viêm mãn tính do Th1. Do đó, nghiên cứu cũng tiến hành kiểm tra tác động của PB lên biểu hiện của IL-12 p40. Ở hình 4, khi PB và LPS (10 µg/mL) làm giảm biện của IL-12 p40, và mức độ giảm tỷ lệ với nồng độ PB sử dụng (p<0.05).

Hình 5: PB làm giảm biểu hiện của iNOS và IL-12 p40 ở đại thực bào

Thảo luận

Mô hình gây viêm mãn tính dựa trên tá chất Freund được xem là mô hình bệnh viêm khớp dạng thấp (Williams 1998). Phương pháp này dựa trên việc tiêm tá chất Freund hòa chỉnh vào bân chân sau của chuột để kích thích quá trình viêm (Newwbould 1963), đáp ứng miễn dịch này có thể do các dipeptide peptidoglycan và muramyl, đây là 2 thành phần của tá chất Freund hoàn chỉnh. Các tế bào trình diện kháng nguyên như đại thực bào đóng vai trò trung tâm trong mô hình gây viêm mãn tính thông qua miễn dịch, ví dụ như mô hình viêm khớp. Mỗi lần hoạt hóa, đại thực bào sẽ tổng hợp các chất trung gian gây viêm như prostaglandin E₂ và các cytokine ví dụ như yếu tố gây hoạt tử u α và interleukin-1, từ đó, sinh ra một loạt các enzyme chịu trách nhiệm khởi đầu quá trình phân hủy sụn và xương (Brennan và cs 2006).

P.betle hay trầu không là một loại dược liệu phổ biến ở Ấn Độ (Nadkarni 1976), dịch chiết lá của loài này có tính chống viêm, và có thể sử dụng trong lâm sàng. Chúng tôi đã kiểm tra khả năng chống viêm của dịch chiết ethanol lá P.betle và hy vọng sẽ tìm thấy cơ chế giải thích cho khả năng chống viêm của dịch chiết này. Các thành phần thực vật của PB chủ yếu các chất thuộc nhóm phenolic, chevibetol và allylpyrocatechol cũng như các dẫn xuất glycoside của chúng (Hình 1). Vì các chất thuộc nhóm phenolic này đều là các chất có khả năng chống viêm mạnh (Surh và cs 2001), nên rất có thể 4 chất này có liên quan đến khả năng chống viêm của PB.

Với khả năng làm giảm sưng ở động vật thí nghiệm sau khi tiêm tá chất Freund hoàn chỉnh (Bàng 2), rõ ràng PB có khả năng chống viêm và chống viêm khớp tốt. Tác dụng chống viêm khớp của PB được minh chứng qua điểm viêm khớp, điều này cũng phần này cho thấy vai trò quan trọng của đại thực bào, một tế bào miễn dịch tham gia vào quá trình phát triển bệnh viêm khớp.

NO là một phân tử tín hiệu và tham gia vào quá trình viêm cũng như đáp ứng miễn dịch. Đại thực bào sinh ra gốc tự do NO thông qua enzyme iNOS, bản thân enzyme này xúc tác cho phản ứng oxi hóa gốc guanidine nitrogen của L-arginine, từ đó tạo ra L-citrulline và NO (MacMicking và cs 1997). NO có thể hoạt hóa cyclooxygenase, từ đó xúc tác cho phản ứng hình thành prostaglandin và leukotriene, đây là các chất trung gian cho phản ứng viêm (Korhonen và cs 2005). Có thể định lượng NO gián tiếp thông qua lượng nitrite, đây là một trong hai sản phẩm ổn định của NO, và có thể được xác định bằng chất thử Griess (Sarkar và cs 2005). Khi đại thực bào được kích thích bằng LPS, lượng NO tăng lên có thể là enzyme iNOS tăng cường hoạt động. Hiện tượng này được ghi nhận không chỉ ở đại thực bào từ phúc mạc (Son và cs 2006) mà còn trên dòng tế bào đại thực bào thương mại (Padwad và cs 2006). Lượng NO tạo thành do LPS (Hình 2) và lượng NO nội bào (Hình 3) giảm xuống sẽ phụ thuốc vào lượng LPS và PB trong môi trường, hiện tượng này gợi ra giả thiết có thể PB đã làm giảm lượng NO, hỗ trợ giải phóng các yếu tố ức chế viêm như prostaglandin, từ đó ngăn cản quá trình viêm xảy ra. Việc giảm sinh NO ở đại thực bào không phải do độc tình của PG và PB (Hình 4) mà do chúng đã bất hoạt đại thực bào.

Có 3 dạng NOS tham gia vào quá trình sản xuất NO, gồm eNOS, nNOS và iNOS, 3 dạng này lần lượt đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì cân bằng nội môi của hệ tuần hoàn, thần kinh và miễn dịch. Khác với 2 dạng còn lại, iNOS được kích hoạt thông qua nhiều kích thích miễn dịch, dưới các kích thích này, enzyme iNOS có thể tăng lượng NO lên hơn 1000 lần so với mức sinh lý bình thường (MacMicking và cs 1997). Ở các tế bào nghỉ, iNOS không biểu hiện ở trạng thái bình thường mà chỉ biểu hiện khi có cách kích thích và tác nhân như các yếu tố viêm cytokine và LPS (MacMicking và cs 1997). Các enzyme có thể kích thích như iNOS và COX-2 có thể làm prostaglandin và NO tăng sinh quá mức, đây đều là các yếu tố then chốt trong quá trình bệnh lý của viêm khớp cũng như các bệnh viêm khác (MacMicking và cs 1997). Tác động của PB tới biểu hiện của iNOS có thể xác định thông qua định lượng mRNA của iNOS thông qua RT-PCR, từ đó cho thấy PB có khả năng ức chế sinh NO của đại thực bào khi kết hợp với LPS (Hình 2, 3 và 5).

Chức năng chính của IL-12, một heterodimeric cytokine do đại thực bào và tế bào gai tiết ra dưới sự kích thích của vi sinh vật hoặc các sản phẩm của vi sinh vật, là cảm ứng và duy trì đáp ứng Th1 (Trinchieri 1995). IL-12 cũng liên quan đến quá trình sinh bệnh các bệnh rối loạn viêm mãn tính do Th-1 ví dụ như đa xơ cứng, viêm khớp, viêm ruột (Adorini 1999). Ở dạng được hoạt hóa, IL-12 là một heterodimer gồm 2 subunit, p40 và p35, được mã hóa được 2 gene riêng biệt. Gene p40 chỉ được tìm thấy ở các tế bào sinh ra IL-12 có hoạt tính (Gubler và vs 1991) và bị kích thích mạnh khi có mặt vi sinh vật vả các sản phẩm của chúng (D’Andrea và cs 1992). Ở trạng thái bệnh lý, iNOS làm tăng lượng NO nội bào, từ đó tăng biểu hiện của IL-12 p40 (Pahan và cs 2001). Bằng phương pháp RT-PCR, có thể thấy PB có thể điều hòa biểu hiện của IL-12 p40 (Hình 5), từ đó, PB có thể tác động tới dòng cascade IL-12 p40- iNOS.

Tóm lại, nghiên cứu này đã chứng minh khả năng chống viêm và chống viêm khớp của dịch chiết ethanol lá P.betle Linn. thông qua ức chế sản xuất NO, từ đó ức chế giải phóng các chất trung gian gây viêm.

Tài liệu tham khảo

1. Adorini, L. (1999) Interleukin-12, a key cytokine in Th1-mediated autoimmune diseases. Cell. Mol. Life Sci. 55: 1610–1625
2. Bhattacharya, S., Subramanian, M., Roychowdhury, S., Bauri, A. K., Kamat, J. P., Chattopadhyay, S., Bandyopadhyay, S. K. (2005) Radioprotective property of the ethanolic extract of Piper betle leaf. J. Radiat. Res. 46: 165–171
3. Brennan, F. M., Foey, A. D., Feldmann, M. (2006) The importance of T cell interactions with macrophages in rheumatoid cytokine production. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 305: 177–194
4. Choudhary, D., Kale, R. K. (2002) Antioxidant and non-toxic properties of Piper betle leaf extract: in vitro and in vivo studies. Phytother. Res. 16: 461–466
5. D’Andrea, A., Rengaraju, M., Valiante, N. M., Chehimi, J., Kubin, M., Aste, M., Chan, S. H., Kobayashi, M., Young, D., Nickbarg, E. (1992) Production of natural killer cell stimulatory factor (interleukin 12) by peripheral blood mononuclear cells. J. Exp. Med. 176: 1387–1398
6. Ganguly, S., Bandyopadhyay, S., Sarkar, A., Chatterjee, M. (2006) Development of a semi automated colorimetric assay for screening anti-leishmanial agents. J. Microbiol. Methods 66: 79–86
7. Gubler, U., Chua, A. O., Schoenhaut, D. S., Dwyer, C. M., McComas, W., Motyka, R., Nabavi, N., Wolitzky, A. G., Quinn, P. M., Familletti, P. C., Gately, M. K. (1991) Coexpression of two distinct genes is required to generate secreted bioactive cytotoxic lymphocyte maturation factor. Proc. Natl Acad. Sci. USA 88: 4143–4147
8. Jeng, J. H., Chen, S. Y., Liao, C. H., Tung, Y. Y., Lin, B. R., Hahn, L. J., Chang, M. C. (2002) Modulation of platelet aggregation by areca nut and betel leaf ingredients: roles of reactive oxygen species and cyclooxygenase. Free Radic. Biol. Med. 32: 860–871
9. Kim, T. S., Kang, B. Y., Cho, D., Kim, S. H. (2003) Induction of interleukin-12 production in mouse macrophages by berberine, a benzodioxoloquinolizine alkaloid, deviates CD4+ T cells from a Th2 to a Th1 response. Immunology 109: 407–414
10. Korhonen, R., Lahti, A., Kankaanranta, H., Moilanen, E. (2005) Nitric oxide production and signaling in inflammation. Curr. Drug Targets Inflamm. Allergy 4: 471–479
11. MacMicking, J., Xie, Q. W., Nathan, C. (1997) Nitric oxide and macrophage function. Annu. Rev. Immunol. 15: 323–350
12. Majno, G., Joris, I. (1996) Inflammation: the actors and their languages. In: Majno, G., Joris, I. (eds) Cells, tissues and disease: principles of general pathology. Blackwell Science, Massachusetts, pp 430–431
13. Majumdar, B., Chaudhuri, S. R., Roy, A., Bandyopadhyay, S. K. (2002) Potent antiulcerogenic activity of ethanol extract of leaf of Piper betle Linn. by antioxidative mechanisms. Ind. J. Clin. Biochem. 17: 49–57
14. Nadkarni, K. M. (1976) Indian Materia Medica, 3rd edn. Popular Prakashan, Bombay, pp 960–964
15. Newbould, B. B. (1963) Chemotherapy of arthritis induced in rats by mycobacterial adjuvant. Br. J. Pharmacol. Chemother. 21: 127–136
16. Olken, N. M., Marletta, M. A. (1993) NG-methyl-L-arginine functions as an alternate substrate and mechanism-based inhibitor of nitric oxide synthase. Biochemistry 32: 9677–9685
17. Padwad, Y., Ganju, L., Jain, M., Chanda, S., Karan, D., Kumar Banerjee, P., Chand Sawhney, R. (2006) Effect of leaf extract of Seabuckthorn on lipopolysaccharide induced inflammatory response in murine macrophages. Int. Immunopharmacol. 6: 46–52
18. Pahan, K., Sheikh, F. G., Liu, X., Hilger, S., McKinney, M., Petro, T. M. (2001) Induction of nitric-oxide synthase and activation of NF-kappaB by interleukin-12 p40 in microglial cells. J Biol. Chem. 276: 7899–7905
19. Portugal, L. R., Fernandes, L. R., Cesar, G. C., Santiago, H. C., Oliveira, D. R., Silva, N. M., Silva, A. A., Lannes-Vieira, J., Arantes, R. M., Gazzinelli, R. T., Alvarez-Leite, J. I. (2004) Infection with Toxoplasma gondii increases atherosclerotic lesion in ApoE-deficient mice. Infect. Immun. 72: 3571–3576
20. Santhakumari, P., Prakasam, A., Pugalendi, K. V. (2003) Modulation of oxidative stress parameters by treatment with Piper betle leaf in streptozotocin induced diabetic rats. Ind. J. Pharmacol. 35: 373–378
21. Sarkar, D., Dutta, A., Das, M., Sarkar, K., Mandal, C., Chatterjee, M. (2005) Effect of Aloe vera on nitric oxide production by macrophages during inflammation. Ind. J. Pharmacol. 37: 371–375
22. Sarkar, M., Gangopadhyay, P., Basak, B., Chakrabarty, K., Banerji, J., Adhikary, P., Chatterjee, A. (2000) The reversible antifertility effect of Piper betle Linn. on Swiss albino male mice. Contraception 62: 271–274
23. Schorlemmer, H. U., Kurrle, R., Schleyerbach, R., Bartlett, R. R. (1999) Disease-modifying activity of malononitrilamides, derivates of leflunomide’s active metabolite, on models of rheumatoid arthritis. Inflamm. Res. 48: S113–S114
24. Shitut, S., Pandit, V., Mehta, B. K. (1999) The antimicrobial efficiency of Piper betle Linn. leaf (stalk) against human pathogenic bacteria and phytopathogenic fungi. Cent. Eur. J. Public Health 7: 137–139
25. Son, C. G., Shin, J. W., Cho, J. H., Cho, C. K., Yun, C. H., Chung, W., Han, S. H. (2006) Macrophage activation and nitric oxide production by water soluble components of Hericium erinaceum. Int. Immunopharmacol. 6: 1363–1369
26. Surh, Y. J., Chun, K. S., Cha, H. H., Han, S. S., Keum, Y. S., Park, K. K., Lee, S. S. (2001) Molecular mechanisms underlying chemopreventive activities of anti-inflammatory phytochemicals: down-regulation of COX-2 and iNOS through suppression of NFkappa B activation. Mutat. Res. 480–481: 243–268
27. Tarpey, M. M., Wink, D. A., Grisham, M. B. (2004) Methods for detection of reactive metabolites of oxygen and nitrogen: in vitro and in vivo considerations. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 286: R431–R444
28. Trinchieri, G. (1995) Interleukin-12: a proinflammatory cytokine with immunoregulatory functions that bridges innate resistance and antigen-specific adaptive immunity. Annu. Rev. Immunol. 13: 251–276
29. Tsai, C. C., Lin, C. C. (1999) Anti-inflammatory effects of Taiwan folk medicine ‘Teng-Khia-U’ on carrageenan- and adjuvantinduced paw edema in rats. J. Ethnopharmacol. 64: 85–89
30. Williams, R. O. (1998) Rodent models of arthritis: relevance for human disease. Clin. Exp. Immunol. 114: 330–332