J. Krzek, H. Woltynska, and U. Hubicka (2009):
“Determination of Gentamicin Sulphate
in Injection Solutions by Derivative Spectrophotometry”, Analytical letter, 42: 473-482
Biên dịch: Phạm Ngọc Sơn
Tóm tắt
Nghiên cứu nhằm xây dựng phương pháp định lượng gentamicin
trong dung dịch tiêm có chứa methyl và propyl hydroxybenzoate bằng phương pháp quang
phổ đạo hàm. Theo đó, lượng gentamicin trong mẫu được xác định thông qua phản ứng
với o-phthal aldehyde, phổ hấp thụ của sản phẩm thu được trong methanol có 3 đỉnh
hấp thụ. Định lượng ở bước sóng λ=
281 nm, nồng độ kháng sinh và giá trị đạo hàm bậc 3 (D3) có quan hệ tuyến tính.
Phương pháp này có độ đặc hiệu cao nhằm định lượng gentamin có trong mẫu chứa
methyl và propyl hydroxybenzoate. Khả năng hồi quy đạt từ 99.38% đến 100.16% và
khoảng tuyến tính từ 0.004%-0.008%. Phương pháp mới có độ chính xác và độ nhạy
cao (RSD= 2.52%, LOD= 1.66x10-4% và LOQ= 5.04x10-4%).
Từ khóa: Phân tích dược phẩm, gentamicin, quang phổ định lượng
Giới thiệu
Gentamicin thuộc họ kháng sinh aminoglycoside (Zejc và
Gorczyca 1999), được sử dụng trong điều trị lâm sàng dưới dạng muối sulphate,
thường có trong dung dịch thuốc mỡ mắt và trong dung dịch tiêm trong cơ.
Giống như các dòng kháng sinh aminoglycoside khác,
gentamicin không hấp thụ tia UV, do đó, không thể sử dụng phương pháp quang phổ
định lượng thông thường để định lượng loại kháng sinh này. Hơn nữa, các thành
phẩn tá dược trong thuốc cũng có thể tác động tới kết quả định lượng.
Theo nhiều tài liệu, phương pháp vi sinh thường được dùng để
xác định hàm lượng các kháng sinh aminoglycoside, trong đó bao gồm cả
gentamicin (Yusuf và cs 1999, Hanes và Herring 2001), ngoài ra các biện pháp
khác như điện di mao quản (Kaale và cs 2000), và các phương pháp sắc ký như sắc
ký bản mỏng (TLC; Prasad và cs 1998), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC; Walker
và Coates 1981, Stead và Richards 1996, Cherlet, Baere và Backer 2000,
Isoherranen và Soback 2000, Posyniak, Zmudzki và Niedzielska 2001, Al-Amound,
Clark và Chrystyn 2002) cũng được sử dụng trong định lượng gentamicin.
Với các dòng thuốc có thành phần phức tạp, Gentamicin thường
được định lượng bằng phương pháp quang phổ hấp sau khi phản ứng với ninhydrin
(Krzed, Stolarczyk và Rzeszutko 2002).
Đối với các dung dịch tiêm, gentamicin thường được dùng kèm
với methyl và propyl hydroxybenzoate, đây là hai chất có khả năng hấp thụ tia
UV rất cao (European Pharmacopeia 2002).
Nghiên cứu này phát triển phương pháp quang phổ đạo hàm UV mới
nhằm định lượng gentamicin sau khi phản ứng với o-phthal aldehyde (Posyniak,
Zmudzki và Niedzielska 2001).
Bên cạnh đó, cũng chưa hề có nghiên cứu nào tương tự được
công bố, do đó, nghiên cứu này có tính thực tiễn cao.
Thí nghiệm
Thiết bị
Các thiết bị được dùng bao gồm: Máy quang phổ hấp thụ Cary
100 Varian Analytical Instruments, Máy tính PC Pentinum MMX, 16 MB RAM, máy in
Hewlet-Packard LaserJet 6L và phần mềm (Microsoft Office 97, Statistica 5.1
edition 97), máy đo pH CP-551, Elmetron, và cân phân tích WPA, Radwag.
Dung dịch chuẩn và mẫu
Dung dịch chuẩn
Gentamicin sulphate s. 0012433 đạt tiêu chuẩn theo Dược điển
Châu Âu 2002, do công ty Polfa Tarchomin
SA (Ba Lan) cung cấp. Khi phân tích, dung dịch gentamicin sulphate được pha bằng
nước cất, thành nồng độ 0.5 mg/mL.
Dung dịch mẫu
Dung dịch tiêm gentamicin (20 mg/mL, s. 410401) do công ty
Polfa Tarchomin (Ba Lan) sản xuất, chứa:
Gentamicin sulphate=
gentamicin 40 mg
Methyl hydroxybenzoate 2.6 mg
Propyl hydroxybenzoate 0.4 mg
Nước 2 ml
Trong phân tích, 1 mL dung dịch tiêm được pha với nước thành
nồng độ 0.4 mg/mL.
Dung dịch o-phthal aldehyde
Dung dịch o-phthal aldehyde được pha trong đệm borate pH
10.4, theo đó, 1 g o-phthal aldehyde được hòa tan trong 5 mL methanol và làm đầy
tới 100.0 mL bằng đệm.
Methyl và Propyl hydroxybenzoate
Cân chính xác 26.00 mg methyl hydroxybenzoate và 4.00 mg
propyl hydroxybenzoate và pha với 20.0 mL methanol. Khi định lượng, 1 mL dung dịch
gốc được pha thành 50.0 mL bằng nước cất.
Định lượng
Cho chính xác 2.0- 4.0 mL dung dịch gentamicin chuẩn vào
bình định mức 25.0 mL, bổ sung 1 mL dung dịch o-phthal adehyde, đun hỗn hợp ở
60oC trong 30 phút. Sau đó làm lạnh bình và làm đầy tới vạch định mức,
làm tương tự đối với các dung dịch mẫu. Hỗn hợp được đo toàn dải sóng từ 200 nm
đến 400 nm và đọc giá trị đạo hàm bậc 3 ở bước sóng λ=281 nm, tính toán hàm lượng dựa trên giá trị D3 của
chuẩn và mẫu.
Kết quả và bàn luận
Trong bình định mức 25.0 mL, 3.0 mL gentamicin sulphate nồng
độ 0.5 mg/mL sẽ phản ứng với 1.0 ml dung dịch o-phthal aldehyde 1%. Hỗn hợp được
cho phản ứng ở 60oC trong 30 phút, làm lạnh và làm đầy bằng
methanol. Sản phẩm thu được từ phản ứng giữa o-phthal adehyde với nhóm amine của
kháng sinh có đỉnh hấp thụ tại bước sóng λ= 233 nm và có vùng hấp thụ trong khoảng từ 250-300 nm
(Hình 1).
Tương tự,
các dung dịch tiêm được pha loãng để có lượng gentamicin tương đương dung dịch
chuẩn. Ngoài ra, trong dung dịch mẫu còn chứa methyl và propy; hydroxybenzoate.
Mẫu trắng
được chuẩn bị tương tự nhưng không có gentamicin (Hình 1).
Hình 1:
Phổ đồ của gentamicin sulphate (a), methyl và propyl hydroxybenzoate (b),
gentamicin sau khi phản ứng với o-phthal adehyde (c) và gentamicin trong hỗn hợp
với methyl và propyl hydroxybenzoate (d).
Hình 2:
Đạo hàm bậc 3 (λ~ 281 nm) của methyl và propyl hydroxybenzoate (a) và
gentamicin sulphate (b).
Phổ đồ của dung dịch chuẩn và dung dịch mẫu tương đối giống
nhau nhưng lại khác nhau về cường độ hấp thụ, mặc dù nồng độ gentamicin
sulphate trong cả hai dung dịch là tương đương nhau.
Sự khác biệt về cường độ hấp thụ ở phổ đồ bậc 0 có thể là do
các thành phần tá dược có trong mẫu thành phẩm.
Do đó, nghiên cứu đã sử dụng phương pháp đạo hàm quang phổ để
hạn chế sai số do tá dược.
Bằng cách sử dụng kỹ thuật “qua bậc 0”, các đạo hàm từ bậc 1
tới bậc 5 có thể được dùng nhằm xác định giá trị đạo hàm bậc 3 (D3) tại bước
sóng 281 nm và hạn chế được các sai số do methyl và propyl hydroxybenzoate
(Hình 2).
Do đó, phương pháp ban đầu đã được tối ưu để nâng cao độ đặc
hiệu, độ nhạy, độ tuyến tính và tính chính xác của số liệu.
Độ đặc hiệu
Phương pháp chuyển phổ đồ ban đầu sang dạng phổ đồ đạo hàm cấp
3 cho phép hạn chế các sai số do tá dược gây ra. Ở bước sóng λ= 281 nm, nồng độ methyl
và propyl hydroxybenozoate không ảnh hưởng tới cường độ hấp thụ D3, do đó, có
thể xem là không gây ra các tín hiệu nhiễu khi định lượng gentamicin sulphate
(Hình 2).
Bên cạnh đó, giá trị đạo hàm bậc 3 không thay đổi khi ủ dung
dịch ở 22oC trong 1 giờ, hơn nữa, giá trị này cũng giữ nguyên khi nồng
độ kháng sinh thay đổi ±10%.
Độ tuyến tính
Để đánh giá độ tuyến tính, điều kiện thí nghiệm vẫn giữ
nguyên như theo mô tả ở trên, nhưng lượng gentamicin sẽ tăng từ 2.0-4.0 mL với độ
tăng mỗi bậc là 0.5 mL. Sự biến động giá trị đạo hàm bậc 3, D3, khi thay đổi nồng
độ gentamicin được mô tả ở Hình 3, từ đó xây dựng đường chuẩn của kháng sinh.
Đường chuẩn D3= f(c) là tuyến tính trong khoảng nồng độ ở trên, với các thông số
cụ thể như sau:
Phương trình hồi quy tuyến tính: D3=
2.5790 c – 0.4 . 10-3
Sai số tiêu chuẩn của ước lượng: Se= 0.00013
Hệ số tương quan: r= 0.99960850
Sai số chuẩn a: Sa=
0.041677
Sai số chuẩn b: Sb=
0.000257
Hình 3: Đạo hàm bậc 3 (D3) vs nồng độ gentamicin sulphate từ
c1= 0.004% đến c5=
0.008%
Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn đo (LOQ)
Các giá trị LOD và LOQ được tính toán dựa trên sai số tiêu
chuẩn của ước lượng (Se) và độ dốc của đường hồi quy, cụ thể như
sau:
LOD= 3.3 x 0.00013/2.579 = 1.66 x 10-4%
LOQ= 10 x 0.00013/2.579 = 5.0407 x 10-4%
Độ lặp
Để xác định độ lặp của phương pháp, 3.0 mL dung dịch chuẩn
gentamicin sulphate được cho vào 7 bình định mức và xác định giá trị D3. Kết quả
lần lượt là 0.01670, 0.01766, 0.01664, 0.01629, 0.01706, 0.01690, 0.01698,
trung bình 0 = 1.689.10-2, độ lệch chuẩn S= 4.26 . 10-4.
Độ lệch chuẩn tương đối RSD (%)= 2.52%.
Độ đúng
Độ đúng của phương pháp được ước tính dựa trên 3 mức nồng độ,
80%, 100% và 120%. Cụ thể, 1 mL của dung dịch gentamicin có nồng độ 0.4 mg/mL
được thêm vào 3 bình định mức, sau đó bổ sung lần lượt 0.8, 1.0 và 1.2 mL dung
dịch gentamicin chuẩn có nồng độ 0.75 mg/mL vào 3 bình và cho phản ứng với
o-phthal aldehyde. Giá trị đạo hàm bậc 3 (D3) tại bước sóng λ= 281 nm được sử dụng để
tính toán độ đúng.
Bảng 1: Kết quả hồi quy
|
Mức nồng độ
(%)
|
Kết quả
(%)
|
Trung bình
|
SD
|
RSD (%)
|
|
80
|
101.33
|
|
|
|
|
|
101.33
|
|
|
|
|
|
100.0
|
100.89
|
0.77
|
0.76
|
|
100
|
100.33
|
|
|
|
|
|
99.38
|
99.38
|
0.48
|
0.48
|
|
|
100.0
|
|
|
|
|
120
|
102.78
|
|
|
|
|
|
102.48
|
101.16
|
2.55
|
2.52
|
|
|
98.22
|
|
|
|
Phân tích dược phẩm
Kết quả từ các thí nghiệm trên cũng một lần nữa khẳng định
khả năng định lượng gentamicin sulphate trong mẫu dung dịch tiêm của phương
pháp. Cụ thể, các kết quả thu được không khác biệt nhiều so với mức hàm lượng
mà nhà sản xuất đã công bố (40 mg/mL) và có độ lặp tốt, khoảng tin cậy ở 95% hẹp.
Từ 5 lần thí nghiệm (n=5), hàm lượng thực tế (mg/mL) ghi nhận được là: 39.38,
39.53, 39.53, 37.76, 39.38, trung bình x= 39.12, RSD= 1.95, khoảng tin cậy ở
p=95% là ±0.946.
Kết luận
Nghiên cứu này được thực hiện nhằm xây dựng một phương pháp
mới trong định lượng gentamicin sulphate bằng phương pháp quang phổ đạo hàm, mà
cụ thể là sau khi kháng sinh phản ứng với o-phthal aldehyde.
Kết quả cho thấy, các thí nghiệm đều có phổ đồ tốt (Hình 1)
với đỉnh hấp thụ ở λ= 233
nm và vùng hấp thụ chủ yếu trong khoảng 260-328 nm, trong đó không có ghi nhận
giá trị hấp thụ của gentamicin khi chưa phản ứng.
Trong
phản ứng, nhóm amine của gentamicin (R-NH2) sẽ phản ứng với o-phthal
aldehyde Ar-CHO trong môi trường kiềm:
Khi lựa
chọn bước sóng để phân tích, bước đầu không ghi nhận bất kỳ kết quả hấp thụ nào
ở bước sóng λ~ 233 nm thỏa mãn. Do đó, để tiến hành định lượng, cần chuyển phổ
đồ ban đầu thành dạng đạo hàm bậc 3.
Có thể
thấy ở bước sóng 281 nm, giá trị đạo hàm bậc 3 có mối quan hệ nhất định đối với
nồng độ chất quan tâm mà không có bất kỳ dấu hiệu nào của hiện tượng nhiễu do
tá dược.
Phương
pháp mới này có vùng tuyến tính rộng, từ 0.004% đến 0.08%, với hệ số tương quan
tốt, r= 0.99357. Từ thí nghiệm đo độ đúng trên 3 giá trị nồng độ từ 80-120%,
các kết quả hồi quy thu được trong khoảng từ 99.38% đến 101.16%. Độ lặp cũng
cho kết quả tốt với RSD 2.52%, số liệu này chỉ ra phương pháp này có thể được sử
dụng như một phương pháp định lượng nhanh, thay thế cho phương pháp vi sinh hiện
đang được dùng (Hanes và Herring 2001).
Một lần
nữa, phương pháp mới được xây dựng trong nghiên cứu này có thể xác định trực tiếp
lượng gentamicin sulphate có trong mẫu dược phẩm chứa methyl và propyl
hydroxybenzoate với độ chính xác cao.
Tài liệu tham khảo
Al-Amoud,
A.I., Clark, B.J., and Chrystyn, H. 2002. Determination of gentamicin in urine samples
after inhalation by reversed-phase high-performance liquid chromatography using
pre-column derivatisation with o-phthalaldehyde. J. Chromatogr. B., 769:
89–95.
Cherlet,
M., Baere, S.D., and Backer, P.D. 2000. Determination of gentamicin in swine
and calf tissues by high-performance liquid chromatography combined with
electrospray ionization mass spectrometry. J.
Mass. Spectr., 35: 1342–1350.
El-Yazgi,
A. 1999. Simplified high-performance liquid chromatographic method for the
determination of gentamicin sulfate in a microsample of plasma: Comparison with
fluorescence polarization immunoassay. Therap.
Drug Monitor., 21: 647–652.
European Pharmacopeia, 4th ed. 2002. Strasbourg,
France: Council of Europe.
Hanes,
S.D. and Herring, V.L. 2001. Gentamicin enzyme-linked immunosorbent assay for microdialysis
samples. Therap. Drug Monitor., 23: 689–693.
Isoherranen,
N. and Soback, S. 2000. Determination of gentamicins C(1), C(1a), and C(2) in
plasma and urine by HPLC. Clin. Chem., 46: 837–842.
Kaale,
E., Leonard, S., Van Schepdael, A., Roets, E., and Hoogmartens, J. 2000. Capillary
electrophoresis analysis of gentamicin sulphate with UV detection after
pre-capillary derivatization with 1,2-phthalic dicarboxaldehyde and mercaptoacetic
acid. J. Chromatogr. A, 895: 67–79.
Krzek,
J., Stolarczyk, M., and Rzeszutko, W. 2002. Spectrophotometric determination of
gentamycin sulfate(VI), dexamethasone, and methyl and propyl 4-hydroxybenzoates
in pharmaceuticals. Chem. Anal., (Warsaw)
47: 299–309.
Posyniak,
A., Z˙ mudzki, J., and Niedzielska, J. 2001. Sample preparation for residue determination
of gentamicin and neomicin by liquid chromatography. J. Chromatogr. A, 914: 59–66.
Prasad,
P.B.N., Rao, A.C.S., Mathur, S.C., Kumar, Y., and Talwar, S.K. 1998. Comparative
HPTLC and HPLC studies on quantitative determination of gentamicin sulphate in
bulk drugs. Indian Drugs, 35:
744–747.
Stead,
D.A. and Richards, R.M. 1996. Sensitive fluorimetric determination of
gentamicin sulfate in biological matrices using solid-phase extraction, precolumn
derivatization with 9-fluorenylmethyl chloroformate and reversedphase
high-performance liquid chromatography. J.
Chromatogr. B, 675: 295–302.
Walker,
S.E. and Coates, P.E. 1981. High-performance liquid chromatographic methods for
determination of gentamicin in biological fluids. J. Chromatogr. A, 223: 131–138.
Yusuf,
A., Al-Rawithi, S., Raines, D., Frayha, H., Toonsi, T.A., Al-Mohsen, I., and
El-Yazgi, A. 1999. Simplified high-performance liquid chromatographic method
for the determination of gentamicin sulfate in a microsample of plasma: Comparison
with fluorescence polarization immunoassay. Therapeutic
Drug Monitoring, 21: 647–652.
Zejc,
A. and Gorczyca, M. 1999. Drug Chemistry
(in Polish), 2nd ed. PZWL. Warsaw, Poland.
Định lượng Gentamicin sulphate trong dung dịch tiêm bằng phương pháp quang phổ đạo hàm
Reviewed by Khoa học đời sống
on
tháng 5 28, 2020
Rating:
Reviewed by Khoa học đời sống
on
tháng 5 28, 2020
Rating:
