Tài liệu tham khảo: Bryan Markey, Finola Leonard, Marie Archambault, Ann Cullinane, Dores Maguire: "Clinical Veterinary Microbiology", Publisher: Mosby, Year: 2013, ISBN: 9780723432371
Môi trường dùng trong nuôi cấy xét nghiệm vi sinh có
thể được phân thành các nhóm sau:
Môi trường xác định hóa học: Trong môi trường này chứa
một lượng xác định các hợp đã biết. Chúng được sử dụng tùy vào mục đích thí
nghiệm, ví dụ môi trường canh thang citrate được dùng trong xét nghiệm vi khuẩn.
Môi trường dinh dưỡng cơ bản: Môi trường chứa các chất
đủ cho vi sinh vật sinh trưởng, đặc biệt là các sinh vật dễ nuôi cấy. Thạch
dinh dưỡng cũng được xem là một loại môi trường dinh dưỡng cơ bản.
Môi trường canh thang giàu dinh dưỡng: Môi trường lỏng,
cho phép vi sinh vật có thể sinh trưởng tốt và bị phát hiện. Đây là môi trường thường dùng trong xét nghiệm
một lượng nhỏ vi sinh vật trong mẫu thuốc tiêm ban đầu. Môi trường canh thang
selenite là một trong các môi trường canh thang giàu dinh dưỡng dùng trong chọn
lọc salmonellae.
Môi trường chọn lọc: Đây là môi trường thạch dùng để
chọn lọc một hoặc một nhóm vi khuẩn đặc biệt, và được dùng trong xét nghiệm vi
sinh vật. Môi trường có chứa các chất ức chế, ngăn cản các vi sinh vật không
mong muốn sinh trưởng. Có rất nhiều môi trường chọn lọc, ví dụ như môi trường
brilliant green và MacConkey, 2 môi trường này cũng được xem là các môi trường chỉ thị.
Môi trường chỉ thị: Đây là môi trường đặc biệt, được dùng
trong xét nghiệm vi sinh vật. Chúng được thiết kế để xác định vi sinh vật dựa
trên các phản ứng sinh hóa trong môi trường. Môi trường chỉ thị thường có chứa
đường lên men được và các chất chỉ thị pH, các này sẽ gây ra biến đổi màu trên
môi trường (Bảng 2.2). Thạch MacConkey chứa đường lên men được lactose và chất
chỉ thị trung tính màu đỏ. Các vi khuẩn như Escherichia
coli sẽ lên men lactose để tạo ra các acid chuyển hóa, từ đó hình thành khuẩn
lạc và có viền màu hồng xung quanh. Do Salmonellae không thể lên men lactose,
nên sẽ dùng peptone trong môi trường để tạo ra sản phẩm chuyển hóa alkaline.
Khuẩn lạc Salmonella sẽ có viền màu vàng nhạt. Các môi trường chỉ thị khác có
thể được sử dụng để tạo ra hydrogen sulphide (Thạch xylose-lysine-deoxycholate,
XLD) hoặc phân giải aesculin (Môi trường Edwards). Môi trường thạch máu, mạch
dù là một môi trường giàu dinh dưỡng nhưng cũng có thể được xem là một môi trường
chỉ để chứng minh khả năng phân giải hồng cầu của một số vi khuẩn đặc biệt
Bảng 2.2: Các chất chỉ thị pH dùng trong xét nghiệm
|
Chất
chỉ thị pH |
Khoảng
pH |
Màu
sắc |
Môi
trường và xét nghiệm sinh hóa |
|
Chỉ
thị Andrade |
7,2-7,5 |
Không
màu- hồng |
Đường
nước peptone |
|
Tím Bromocresol |
6,8-5,2 |
Tím-
vàng |
Môi
trường canh thang lysine decarboxylase, thạch tím |
|
Xanh Bromothymol |
7,6-7,0-6,0 |
Xanh
dương- xanh lá- vàng |
Môi
trường O-F, Môi trường Simmons citrate, Smith-Baskerville (Bordetella spp.) |
|
Litmus |
8,3-4,5 |
Xanh
dương- đỏ |
Môi
trường sữa Litmus |
|
Đỏ Methyl |
6,4-4,4 |
Da
cam- đỏ |
Xét
nghiệm đỏ methyl |
|
Đỏ Neutral |
8,0-6,8 |
Vàng
nhạt- đỏ |
Thạch
MacConkey, Môi trường chọn lọc Yersinia. |
|
Đỏ Phenol |
8,4-6,8 |
Đỏ-
vàng |
XLD,
thạch brilliant green và TSI, đường nước peptone, thạch urea Christensen |
Các ví dụ về môi trường và xét nghiệm được liệt kê ở Bảng
2.3 và Hình 2.16- 2.20. Môi trường có thể được mua thương mại dưới dạng bột
khan hoặc dưới dạng đĩa pre-poured.
Bảng 2.3. Ví dụ một số môi trường dùng trong xét nghiệm
vi sinh
|
Môi
trường |
Sử
dụng |
Đường
và các chất khác |
Chỉ
thị pH |
Ức
chế |
|
Môi
trường dinh dưỡng |
Môi
trường chứa các chất dinh dưỡng cơ bản, ít khi dùng để nuôi các sinh vật khó |
- |
- |
- |
|
Thạch
máu |
Đa
số các vi khuẩn đều sinh trưởng được, bao gồm cả các vi khuẩn khó nuôi |
Tế
bào hồng cầu (Xét nghiệm tan huyết) |
Đỏ
neutral |
|
|
Thạch
MacConkey |
Dùng
trong nuôi cấy Enterobacteriaceae và một số vi khuẩn gram âm |
Lactose |
Đỏ
neutral |
Muối
mật |
|
Thạch
brilliant green |
Phân
lập Salmonella và một số vi khuẩn
khác |
Lactose,
Sucrose |
Đỏ
phenol |
Nhuộm
brilliant green |
|
Thạch
XLD |
Phân
lập Salmonella và một số vi khuẩn
khác |
Xylose,
lactose sucrose, lysine và H2S |
Đỏ
phenol |
Muối
mật |
|
Thạch
TSI |
Xác
định Salmonella |
Lactose,
sucrose, dextrose, H2S |
Đỏ
phenol |
- |
|
Thạch
canh thang selenite |
Thạch
canh thang giàu dinh dưỡng để phân lập salmonellae |
- |
- |
Selenite |
|
Thạch
EMB |
Xác
định Escherichia coli |
Lactose,
saccharose |
Xanh
eosin và xanh methylene |
- |
|
Môi
trường Edwards |
Chọn
lọc streptococci, chỉ thị phân giải aesculin và tan huyết |
Aecsulin Hồng
cầu |
- |
Tím
crystal và thallous sulphate |
|
Thạch
cơ bản tím + 1% maltose |
Phân
biệt Staphyloccus |
1%
maltose |
Tím
Bromocresol |
- |
|
Thạch
chocolate |
Môi
trường giàu dinh dưỡng để nuôi cấy Haemophilus spp. |
Phân
giải tế bào, giải phóng yếu tố X và V |
- |
- |
Chuẩn bị môi trường
Công đoạn này nên tuân theo hướng dẫn của nhà sản xuất, tuy nhiên cũng nên lưu ý một số điểm sau:
- Không được sử dụng các chất tẩy rửa hoặc các chất hóa học tương tự để làm sạch đồ thủy tinh
- Không nhất thiết phải khử trùng đồ thủy tinh nếu không đổ môi trường đã khử trùng vào
- Sau khi cân, môi trường được đổ trong bình thủy tinh và thêm nước vào, phải sử dụng nước khử trùng trong bình thủy tinh, do chúng không chứa chloride và các ion kim loại nặng, làm ức chế sinh trưởng của vi khuẩn.
Bình thủy tinh pha môi
trường cần có dung tích lớn gấp 2 gần lượng môi trường cần pha, do khi khuấy và
đun môi trường, bọt sẽ không bị trào ra khỏi bình. Môi trường không chứa thạch
có thể được khuấy cho tan, nhưng với môi trường khan có chứa thạch, cách tốt nhất
để hòa tan là đun sôi và khuấy liên tục bằng que thủy tinh hoặc tấm gia nhiệt
có kèm theo hệ thống khuấy từ. Môi trường khan sau khi hòa tan sẽ được khử
trùng tại nhiệt độ 121oC trong 15 phút. Một số loại môi trường, như
môi trường Edwards, có chứa các thành phần không bên với nhiệt, có thể được hấp
khử trùng ở 115oC trong 20 phút hoặc theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Trong khi đó, một số loại môi trường như thạch brilliant green, có chứa các chất
ức chế sinh trưởng của vi khuẩn, thì không cần thiết phải hấp khử trùng, mà chỉ
cần đun sôi. Các môi trường có chứa thạch nên được làm lạnh trong bể nước sau
khi sấy khử trùng để hạ nhiệt độ xuống còn 50-54oC trước khi đổ ra
đĩa Petri. Thạch sẽ đông lại ở 42oC. Đối với đĩa Petri chuẩn (90
mm), nên đổ 15 ml môi trường thạch hoặc đổ 1/3 đĩa. Do dó, 1 lít môi trường có
thể đổ được 60-70 đĩa. Một số chất bổ sung vào môi trường như huyết tương hay hồng
cầu sẽ không chịu được nhiệt độ cao và nên được thêm vào môi trường sau khi môi
trường đã nguội còn 50-54oC. Sau khi đổ, môi trường được làm nguội ở
nhiệt độ phòng trong vài giờ và ủ tiếp ở nhiệt độ 37oC. Để sử dụng,
bề mặt thạch không được xuất hiện mốc. Khi bảo quản, thạch đặt hướng lên và giữ
ở nhiệt độ 4oC. Các hệ thống thương phẩm cho phép chuẩn bị nhiều đĩa
thạch một lúc hơn so với đổ thủ công.
Chuẩn bị môi trường thạch máu
Thạch máu được chuẩn bị từ
bột khan, khử trùng và làm lạnh xuống 50-54oC. Máu đã khử trùng được
bổ sung với tỷ lệ 5-10% vol/vol vào môi trường và lắc đều trước khi đổ vào đĩa.
Nếu có bọt hình thành trên bề mặt, có thể hơ qua lửa để đuổi bọt trước khi thạch
đông lại. Nếu máu khử trùng được bảo quản lạnh, nên làm ấm máu lên 37oC
trước khi thêm vào thạch để tránh sốc nhiệt.
Thu máu khử trùng
Máu bò, ngựa hoặc cừu đều có thể được dùng trong xét nghiệm vi sinh thú y. Máu khử trùng có thể được mua thương mai hoặc được thu từ thú non, máu lúc này sẽ không có kháng thể kháng lại các yếu tố vi sinh gây bệnh cũng như chưa được xử lý qua các chất kháng sinh. Cần thực hiện các thao tác tiệt trùng. Ở khu vực xung quanh tĩnh mạch nên được cạo và rửa với cồn ethylic 70%, lau và để khô hoàn toàn trước khi chích mạch. Để ngăn ngừa máu đông, có thể sử dụng một trong các kỹ thuật sau:
- Thu máu bằng các bộ kit thu máu người
- Thu máu và các thiết bị đã được khử trùng gồm một ống thông vào một bình nón chứa các hạt thủy tinh (3 mm) (Hình 2.21). Bình được lắc liên tục trong thời gian thu mẫu và duy trì lắc tối thiểu 5 phút sau khi thu máu xong. Máu loại fibrin này có thể được trữ trong các chai khử trùng và được bảo quản trong tủ lạnh. Các hạt thủy tinh sau đó được loại fibrin và tái sử dụng.
Các dung dịch chống đông
vô trùng như natri citrate 0,2% có thể được thêm vào trong bình nón trước hoặc
ngay sau khi thu máu.
Lựa chọn môi trường
Để phân lập vi khuẩn, có
thể sử dụng thạch máu hoặc thạch MacConkey. Môi trường thạch máu có thể kích
thích sinh trưởng của đa số các vi khuẩn gây bệnh, trong khi đó, rất nhiều vi
khuẩn gram âm mọc trên thạch MacConkey. Việc so sánh khả năng sinh trưởng trên
2 môi trường này có thể chỉ ra được loại vi khuẩn được phân lập. Các môi trường
đặc thù cho một số loại vi sinh được đề cập ở phần 2.
Cấy khuẩn vào môi trường
Các mẫu sinh thiết mô sẽ
dễ thao tác hơn. Trước hết, mẫu sẽ được đặt trong một đĩa Petri trống. Dao và kẹp
nên được rửa bằng cồn ethylic 70% trước khi thao tác và được bảo quản lạnh. Khi
cạo mô, nên đặc biệt chú ý đến các khu vực góc. Một lượng nhỏ mô sau khi nạo sẽ
được đặt trong đĩa hoặc giếng để nuôi cấy. Ngoài ra, một số loại mô còn được tạo
vệt smear trên lam kính để nhuộm.
Khi mẫu ở dạng lỏng hoặc
bán lỏng thì phương pháp cấy khuẩn tốt nhất là dùng tăm bông khử trùng. Đầu
tiên, cần đảo mẫu cho đều bằng tăm bông rồi lấy tăm đó đi cấy khuẩn. Trước khi
loại bỏ, có thể sử dụng tăm bông đó để soi dưới kính hiển vi. Khi nuôi cấy vi
khuẩn trên đĩa thạch, nên bắt đầu với môi trường không ức chế trước, ví dụ như
thạch máu, và sau đó mới nuôi cấy trên các môi trường ức chế hoặc chọn lọc, ví
dự như thạch MacConkey.
Cấy ria trên đĩa thạch
Để phân lập vi khuẩn, sau khi cấy ria, cần quan sát được
hình thái khuẩn lạc, độ nhạy kháng thể cũng như các xét nghiệm sinh hóa khác.
Phương pháp cây ria 4 phần, dùng để cấy trên toàn bộ đĩa thạch, là phương pháp
phổ biến nhất trong xét nghiệm sinh phẩm (Hình 2.22).
Nhãn trên nắp đĩa thạch cần ghi rõ loại sinh phẩm,
ngày ủ và số tham chiếu, nên sử dụng các loại bút chống trôi để viết trên cạnh
của đĩa để tránh bị che khuất khi khuẩn lạc mọc. Có thể sử dụng 2 vòng cấy đồng
thời, một vòng để cấy và một vòng chờ nguội. Các vòng cấy nên được hơ qua lửa
(Hình 2.23) trước khi sử dụng và sau khi cấy 1, 2 và 3 lần. Số lần hơ lửa vòng
cấy phụ thuộc vào số lượng vi khuẩn ước tính có trong mẫu. Vòng cấy phải được
hơ lửa sau khi cấy 4 lần, trước khi loại bỏ. Vòng cấy nên được đặt song song với
bề mặt đĩa thạch để tránh trường hợp vòng làm xước bề mặt hoặc đâm vào thạch
(Hình 2.24). Bên cạnh đó, cũng có thể sử dụng các vòng cấy nhựa dùng 1 lần, tuy
nhiên nên thay vòng cấy sau mỗi lần cấy. Các vệt 1, 2 và 3 nên được đặt gần với
cạnh đĩa và để khoảng trống cho lần cấy 4, nhờ đó hy vọng có thể tách được khuẩn
lạc (Hình 2.25). Diện tích thạch nên được tận dụng tối đa, các vệt càng gần
nhau càng tốt.
Đối với các mẫu có ít vi sinh vật, như mẫu sữa viêm vú
bò, có thể sử dụng phương pháp cấy ria 2 hoặc cấy ria 4 (Hình 2.26).
Ủ đĩa nuôi cấy
Tương tự như môi trường nuôi cấy, nhiệt độ và thời
gian ủ cũng là những yếu tố quan trong ảnh hưởng đến kết quả nuôi cấy. Tuy thuộc
vào loại vi khuẩn mà sẽ có những điều kiện ủ đĩa nuôi cấy thích hợp, cụ thể gồm
các yếu tố nhiệt độ, thời gian và điều kiện không khí.
Điều kiện không khí
- Không khí bình thường (Hiếu khí- Aerobic) là điều kiện
sinh trưởng của đa số các loại vi khuẩn và toàn bộ các loài nấm
- 5-10% CO2
Actinobacillus pleuropneumoniae
Actinomyces viscosus
Brucella spp.
Campylobacter jejuni và C. fetus (tối ưu ở 6% O2,
10% CO2, 84% N2)
Dermatophilus
congolensis (phân lập cơ bản)
Francisella tularensis
Haemophilus spp.
Histophilus spp.
Taylorella
equigenitalis
- Kỵ khí (Anaerobic)
Actinomyces bovis
Bacteroides spp.
Clostridium spp.
Actinobaculum suis
Fusobacterium spp.
Peptoniphilus spp.
Brachyspira hyodysenteriae.
Nhiệt độ ủ
- 37oC: Đây là nhiệt độ lý tưởng của đa số
các vi khuẩn gây bệnh trên động vật bao gồm cả vi nấm và nấm
- 42oC
Campylobacter jejuni
Brachyspira hyodysenteriae
- 28oC- 30oC:
Các huyết thanh chủng Leptospira
- 25oC: Nhiệt
độ sinh trưởng của các loại nấm da, trừ Trichophyton
verrucosum sinh trưởng tốt ở 37oC
- 4oC: Đây là
nhiệt độ tăng sinh lạnh của Listeria monocytogenes (Mẫu mô não) và Yersinia
enterocolitica và Y. pseudotuberculosis (Mẫu phân)
Thời gian ủ
- 24-48 giờ: là thời gian
sinh trưởng nhanh của đa số vi khuẩn
- 48-72oC: là
thời gian sinh trưởng của một số loại vi khuẩn trên môi trường chọn lọc
- 4-6 ngày:
Brucella
spp.
Campylobacter spp.
Nocardia asteroides
Mycoplasma spp.
Atypical mycobacteria
Các loại nấm sinh trưởng
nhanh
- 2-3 tuần: Thời gian
sinh trưởng của đa số các loại nấm da (T. verrucosum có thể nuôi kéo dài tới 5 tuần) và Mycobacterium
avium.
-
3-8 tuần: Mycobacterium bovis
-
4-16 tuần: Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis.
Các vi khuẩn không sinh trưởng trên môi trường thạch thông thường
Nhó này gồm rickettsiae, mycoplasmas, Chlamydophila
spp., Clostridium piliforme, Lawsonia intracellularis và một
số mycobacteria. Trong đó, có rất nhiều vi sinh vật có thể cấy trên môi trường
có chứa lòng đỏ trứng gà.
Bảng 2.4 đã liệt kê một số đặc điểm cơ bản để phân lập
vi khuẩn trên môi trường cơ bản (thạch máu và thạch MacConkey) và hình thái của
chúng khi nhuộm gram.
Thải bỏ môi trường và vật liệu nuôi cấy
Đây là một điểm quan trọng trong xây dựng phòng thí
nghiệm vi sinh, cần thải bỏ môi trường và vật liệu nuôi cấy để tránh gây nguy hại
cho sức khỏe con người. Các phương pháp tiêu hủy sinh vật gây bệnh gồm:
- Đặt vật liệu vào trong
túi và khử trùng bằng phương pháp hấp tiệt trùng
- Cho vật liệu vào túi nhựa
chống rò rỉ và thiêu hủy
- Một phương pháp khác
cũng được chấp nhận là ngâm môi trường và vật liệu nuôi cấy trong xà phòng
trong tối thiểu 48 giờ trước khi thải bỏ.
Các vật liệu chưa vi sinh
vật gây bệnh nên được thải ra khỏi phòng thí nghiệm sau khi đã được tiệt trùng.
Reviewed by Khoa học đời sống
on
tháng 8 07, 2020
Rating:
